JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 5:04 dk. • July 8th, 2025
İki CD8 + T hücresi popülasyonunu ele alalım: T hücresi ve ko-stimülatör reseptörlerin antikor aracılı katılımı yoluyla önceden aktive edilmiş efektör CD8 + T hücreleri ve miyeloid türevi baskılayıcı hücreler tarafından inhibe edilen baskılanmış CD8 + T hücreleri.
Bu T hücrelerini, nükleer kısıtlı bir floresan proteini eksprese eden kanser hücreleri ile bazal membran kaplı kuyucuklara ekleyin.
Pipet: florojenik bir kaspaz-3 substratı - kaspaz-3 tanıma bölgesi içeren bir peptit ile konjuge edilmiş DNA bağlayıcı bir florojenik boya.
Kuluçkaya yatmak. Efektör T hücre reseptörleri, kanser hücreleri üzerindeki sınıf I MHC-peptit kompleksine bağlanarak perforinler ve granzimler içeren sitotoksik granüllerin salınımını tetikler.
Perforinler, kanser hücre zarı gözenekleri oluşturarak granzim girişine ve kaspaz aktivasyonuna izin vererek apoptozu başlatır.
Aktive edilmiş kaspazlar ayrıca florojenik kaspaz substratını parçalayarak DNA'ya ve floresanlara bağlanan boyayı serbest bırakır.
Bir floresan mikroskobu altında, efektör T hücreleri ile birlikte kültürlenen kanser hücreleri, kanser hücresi apoptozunu gösteren çift nükleer floresan sergiler.
Buna karşılık, baskılanmış T hücreleri ile birlikte kültürlenen kanser hücreleri, apoptotik olmayan hücreleri düşündüren sadece nükleer protein floresan gösterir.
Önceden aktive edilmiş bir CD8 pozitif T hücresi hedef hücre ko-kültürü oluşturmak için, önce mikroskopi için uygun 96 oyuklu düz tabanlı bir plakanın uygun kuyucuklarına 30 mikrolitre 1 ila 100 seyreltilmiş büyüme faktörü azaltılmış çözünür bazal membran matrisi ekleyin. Matrisi eşit şekilde yaymak için plakayı sallayın ve plakayı en az bir saat hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Plaka dengelenirken hedef hücreleri hazırlayın. Ortamı aspire edin, PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1 mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin.
Nazik pipetleme ile fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 9 mililitre DMEM ekleyin ve ayrışmış hücreleri tüplere aktarın. Hücreleri santrifüjledikten sonra, peleti 500 mikrolitre EDMEM içinde yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan hücreleri bir hücre süzgecinden geçirin ve canlı hücreleri sayın. Ardından, buz üzerinde taze EDMEM'de yoğunluğu mililitre başına 4 kez 10 üzeri dördüncü hedef hücreye ayarlayın.
Daha sonra, hücreleri tek hücreli bir süspansiyona yeniden süspanse etmek için önceden aktive edilmiş CD8 pozitif T hücrelerini birkaç kez pipetleyin ve yüzen T hücrelerini koşul başına 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Oyuk başına 200 mikrolitre PBS ile kalan hücreleri toplayın, yıkamaları uygun 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve santrifüjleyin. Ortamı aspire edin ve santrifüjleme için her tüpe 1 mililitre EDMEM ekleyin.
Santrifüjlemeden sonra, peletleri tüp başına 100 mikrolitre taze EDMEM içinde yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, her tüpteki hücreleri, mililitre ortam başına önceden aktive edilmiş beşinci CD8 pozitif T hücresine 1.6 kat 10 yoğunluğa ayarlayın ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Hücreler hazır olduğunda, 96 oyuklu mikroskopi plakasının her bir oyuğundan bazal membran matrisini aspire edin ve karıştırarak plakanın iç 60 oyuğundaki ayrı oyuklara 50 mikrolitre hedef hücre ekleyin.
Uygun kuyucuklara mililitre IL-2 başına 4 kez 10 ila üçüncü birim ile takviye edilmiş 25 mikrolitre EDMEM ve 10 mikromolar florojenik kaspaz-3 substratı ekleyin. Daha sonra, uygun kuyucuklara 25 mikrolitre önceden aktive edilmiş CD8 pozitif T hücresi ekleyin ve son olarak, toplam hacmi 100 mikrolitreye kadar olacak şekilde uygun kuyucuklara EDMEM ekleyin. Boş kuyucukların tamamına 200 mikrolitre PBS veya steril su ekleyin, plakayı sallayın ve plakayı 10 dakika boyunca düz bir yüzeyde bırakın.
Hücreleri görüntülemek için, mikroskobu faz kontrastlı görüntülerin yanı sıra nükleer kısıtlı floresan proteini için uygun floresan kanalları ve deneyde kullanılan florojenik aktive kaspaz-3 substrat floroforlarını elde edecek şekilde ayarlayın. Ardından, faz kontrastlı her deneysel kuyunun ve en az 72 saat boyunca her bir ila üç saatte bir iki floresan kanalının görüntülerini yakalayın.