İnsan Gözyaşı Örneklerinde Sitokinleri Analiz Etmek için Multipleks Boncuk Bazlı Bir Test

Yıkanmış bir tahlil plakasına insan gözyaşı örnekleri ve bir antikor boncuk kokteyli ekleyin.

Antikorlar, çoklu sitokin tespitini kolaylaştıran, farklı spektral imzalara karşılık gelen değişen oranlarda florofor ile emprenye edilmiş renk kodlu manyetik boncuklara bağlanır.

Gözyaşı sitokinleri, karşılık gelen boncuk bağlı yakalama antikorlarına bağlanır.

Manyetik bir plaka yıkayıcı kullanarak, antikor-boncuk komplekslerini çökeltin. Tampon kullanarak, bağlanmamış biyomolekülleri çıkarın.

Bağlı sitokinlere bağlanan biyotinile tespit antikorları ekleyin.

Biyotinile antikorlara bağlanan pipet streptavidin-fikoeritrin konjugatı.

Plaka yıkayıcıyı kullanarak, bağlanmamış kuyu içeriğini çıkarın. Kılıf sıvısında sitokine bağlı kompleksleri yeniden süspanse edin.

Numune analizi sırasında, akışkan sistem boncuk komplekslerini optik düzeneğe taşır.

İlk lazer, iç boncuk boyalarını aktive eder ve elde edilen sinyal spesifik sitokinleri tanımlar.

İkinci lazer, sinyal yoğunluğu sitokin konsantrasyonunu temsil eden boncuk kompleksine bağlı raportör molekülü aktive eder ve çoklu sitokinlerin aynı anda miktar tayinini sağlar.

Boncuk bazlı multipleks testini gerçekleştirmek için, tüm reaktifleri oda sıcaklığına getirin ve beş ila 10 saniye boyunca girdaplayın. Ayrıştırılmış gözyaşı örnekleri testten önce eksi 80 santigrat derecede saklandıysa, donmuş gözyaşı ekstraktlarını buz üzerinde çözün ve örnekleri beş dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Çalışan insan sitokin standartları QC-1, QC-2 ve numuneler için dikey konfigürasyonda bir tahlil çalışma sayfası hazırlayın.

Plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre 1x yıkama tamponu ekleyin ve bir plaka kapatıcı ile kapatın. Ardından, plakayı oda sıcaklığında bir tabak çalkalayıcı üzerinde 10 dakika inkübe edin. Ardından, plakayı ters çevirerek 1x yıkama tamponunu boşaltın ve kuyucuklarda kalan yıkama tamponu miktarını gidermek için emici havlulara birkaç kez vurun.

Daha sonra, çalışan her insan sitokin standardı QC-1, QC-2'den 25 mikrolitre ekleyin ve sadece tahlil tamponu ve numuneleri uygun kuyucuklara ekleyin. Her kuyucuğa 25 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Daha sonra kuyucuklara 25 mikrolitre 1x antikor boncuk kokteyli çözeltisi ekleyin.

Antikor boncuk çözeltisi ışığa duyarlı olduğundan, plakayı kapatın ve test sırasında ışıktan korumak için alüminyum folyo ve plaka kapağı ile örtün. Plakayı gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, plakayı otomatik bir manyetik plaka yıkayıcının plaka rafına yerleştirin ve manyetik boncukları kuyunun dibine yerleştirmek için bir dakika bekletin.

Kuyu içeriğini aspire edin ve otomatik manyetik plaka yıkayıcı kullanarak kuyu başına 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Plakayı bir dakika bekletin ve ardından kuyu içeriğini daha önce olduğu gibi aspire edin ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Her oyuğa 25 mikrolitre tespit antikor çözeltisi ekleyin. Plakayı kapatın, alüminyum folyo ve plaka kapağı ile örtün ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, her bir oyuğa 25 mikrolitre streptavidin-fikoeritrin çözeltisi ekleyin ve plakayı kapatıp kapattıktan sonra, oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, plakayı manyetik bir plaka yıkayıcıya yerleştirin ve bir dakika bekletin. Ardından, kuyu içeriğini aspire edin ve kuyucuk başına 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Bir dakika bekletin, ardından yıkamayı bir kez daha tekrarlamadan önce kuyu içeriğini aspire edin. Her kuyucuğa 150 mikrolitre kılıf sıvısı ekleyin. Ardından, plakayı okumaya ve sitokin konsantrasyonlarını analiz etmeye devam etmeden önce antikor boncuklarını yeniden süspanse etmek için plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.