İnsan Serumunda Nötralize Edici Antikor Titrelerini Ölçmek için Bir Mikronötralizasyon Testi

Bir mikronötralizasyon testi için, influenzaya özgü nötralize edici antikorların azalan konsantrasyonları ile ısıyla inaktive edilmiş, seri olarak seyreltilmiş insan serumu içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Patojenik influenza virüslerini tanıtın. Serum antikorları virüslerle etkileşime girer ve onları nötralize eder; Bununla birlikte, daha yüksek serum dilüsyonları sınırlı virüs nötralizasyonu sergiler.

Madine-Darby Köpek Böbrek hücreleri veya MDCK hücreleri ile tohum, yüzeylerinde insan sialik asit kalıntılarını aşırı eksprese eder.

Daha yüksek seyreltmede, nötralize edilmemiş influenza virüsleri, hücrelerin sialik asidi ile birleşir ve viral genomu hücre sitoplazmasına bırakır.

Viral genler kopyalanır ve konakçı hücre içindeki viral proteinlere ve nükleoproteinlere çevrilir.

Fiksasyon ve geçirgenlik için yüksek konsantrasyonda aseton ile muamele edin.

Viral nükleoproteinlerle etkileşime giren primer antikorları tanıtın.

Birincil antikorlarla etkileşime giren enzim konjuge ikincil antikorlarla kaplama. Enzimin substratı ile yıkayın ve işlemden geçirin, renkli bir ürün elde edin.

Renk yoğunluklarını ölçün ve bunları serum seyreltmesine karşı çizin; Yüzde elli virüs nötralizasyonu elde eden en yüksek serum seyreltmesi, nötralizasyon titresini temsil eder.

MN testinin 1. gününde, serumları 37 santigrat derece su banyosunda çözdürün ve çözüldükten hemen sonra çıkarın. Metin protokolünde açıklandığı gibi, insan serumlarını 56 santigrat derece su banyosunda 30 dakika boyunca ısıyla etkisiz hale getirin. Daha sonra, serumları buzun üzerine yerleştirin ve 1 ila 10 ön seyreltme elde etmek için virüs seyrelticiyi seruma ekleyin.

Bir virüsle test etmek için, 11 ve 12 numaralı sütunlar hariç B'den H'ye kadar olan satırlara 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Daha sonra, A1 ila A10 sütunlarına 10 seyreltilmiş serumdan 1'inden 100 mikrolitre ekleyin. A'dan H'ye kadar olan sıralardan iki kat seri seyreltme yapın ve son 50 mikrolitreyi H satırına atın.

Virüs kontrolü için A12, B12, C12 ve D12 kuyularına 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Hücre kontrolü için E12, F12, G12 ve H12 kuyularına 100 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Kontrol serumları için, 100 mikrolitre seyreltilmiş kontrol serumu A kuyusu, sütun 11'e ekleyin ve B11'den H11'e kadar olan kuyulara 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Seri olarak seyreltmeye devam edin. Plakaları örtün ve virüs ilavesi için hazır olana kadar 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Virüs ilavesi için, virüsü virüs seyreltici ile 50 mikrolitrede 100 TCID50'ye seyreltin. Arka titrasyon plakalarındaki sütun 11 ve tüm plakalardaki hücre kontrol kuyuları E12, F12, G12 ve H12 hariç tüm kuyucuklara 50 mikrolitre seyreltilmiş virüs ekleyin. Sütun 11'deki tüm kuyucuklara 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Daha sonra, ilk kuyucuğa 50 mikrolitre içinde 100 TCID50'de 50 mikrolitre virüs ekleyin.

Daha sonra, iki kat seri seyreltme gerçekleştirmek için 50 mikrolitreyi karıştırın ve ardışık kuyucuklara aktarın. Virüs taşınmasını önlemek için pipet uçlarını kuyucuklar arasında değiştirin. H11 kuyusundan 50 mikrolitre atın, ardından son hacmi 100 mikrolitreye getirmek için sütun 11'e 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Karıştırmak için plakalara dokunun. Plakaları 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte inkübe edin, ardından birinci gün MDCK hücre ilavesi ve ikinci gün ELISA'yı daha önce olduğu gibi gerçekleştirin.

Birincil ve ikincil antikorları ekledikten sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, substrat ekleme ve plaka okuması gerçekleştirin. Plakaları 300 mikrolitre yıkama tamponu ile beş kez yıkayın ve tüy bırakmayan bir mendil üzerine hafifçe vurun. Her oyuğa 100 mikrolitre taze hazırlanmış OPD substratı ekleyin. Daha sonra, virüs kontrol kuyuları 0,8 ila 3 arasında 490 nanometrede bir optik yoğunluğa ulaşana kadar plakaları oda sıcaklığında inkübe edin, hücre kontrolü düşük arka plan OD'sinde 0,2'den azdır. Daha sonra, tüm kuyucuklara 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin.

Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak kuyuların OD'sini 490 nanometrede okuyun. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi her serum örneğinin nötralize edici antikor titresini belirleyin.