JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:42 dk. • July 8th, 2025
Pirinç fidelerinden kesilmiş tek tip kılıf segmentleri ve pirinç bitkisi yapraklarından elde edilen yaprak diskleri içeren bir mikroplaka alın.
Steril su ekleyin ve yara stresinden iyileşmeyi sağlamak için gece boyunca inkübe edin.
Patojenle ilişkili bir moleküler model veya PAMP görevi gören bakteriyel flagelladan türetilen bir immünojenik peptit ekleyin.
Kesilen kenarlardaki bitki hücreleri, örüntü tanıma reseptörleri aracılığıyla PAMP'lara bağlanır.
Bağlanma, solunum patlaması oksidaz homoloğu veya RBOH olarak adlandırılan plazma zarı lokalize bir enzimi aktive ederek aşağı akış sinyalini tetikler.
Aktive edilmiş RBOH, apoplastta - hücreler arası boşlukta reaktif oksijen türleri veya ROS üretir. Üretilen ROS, hidrojen peroksite dönüştürülür.
Bir peroksidaz enzimi ve bir kemilüminesan substrat ekleyin.
Peroksidaz, substratı, enerjiyi ışık olarak serbest bırakan ve temel duruma geri dönen uyarılmış bir durum ara ürününe dönüştürmek için hidrojen peroksit kullanır.
PAMP tedavisinden hemen sonra bir ROS patlamasını gösteren keskin bir artışı tespit etmek için her iki doku tipinde de lüminesansı ölçün.
ROS testinden bir gün önce ön işlem için 10 günlük pirinç fidelerinin kılıfını keskin bir tıraş bıçağı veya cerrahi bıçakla 3 milimetrelik segmentler halinde kesin. 5 kılıf segmentini, 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su içeren 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının ayrı bir kuyusuna yerleştirin.
Yaprak disklerini dört ila altı haftalık pirinç bitkilerinden bir piston ile biyopsi zımbası kullanarak kesin. Veri değişimini azaltmak için yaprak disklerini her zaman ana yekenin ikinci yaprağının orta üçte birlik kısmından kesin. Daha sonra, ön işlem için 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su içeren 96 oyuklu bir mikrotitre plakanın ayrı bir kuyucuğuna bir yaprak diski yerleştirin. Yaprak tarafı ile ilişkili varyasyonu önlemek için su ön arıtımı için tüm yaprak disklerini bir mikrotitre plakasının kuyularında yüzer ve yukarı bakacak şekilde tutun.
9.4 ml 50 mikromolar tris-HCl, 400 mikrolitre L-012 çözeltisi, 100 mikrolitre yaban turpu peroksidaz ve 100 mikrolitre flg22'yi birleştirerek ortaya çıkarma çözeltisi hazırlayın. Kuyucuklara 200 mikrolitre ortaya çıkarma çözeltisi ekleyin.
Yazılımı başlatın ve yeni bir protokol oluşturmak veya mevcut bir protokolü kullanmak için Deneyler düğmesine tıklayın. Plakayı ayarlamak için açılır penceredeki Prosedür'e tıklayın ve izlenecek plakadan kuyuları seçin. Kinetiği Başlat'a tıklayın ve deneysel gereksinimlere bağlı olarak çalışma zamanını 30 dakika veya daha uzun bir süreye ayarlayın. Okumaları mümkün olduğunca sık elde etmek için minimum aralığı seçin ve entegrasyon süresi için sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 1 saniye veya daha uzun bir süre seçin.
Ayarları onaylamak için Doğrula'ya ve ardından Tamam'a tıklayın. Ardından açılır pencerede Yeni Bir Plaka Algıla'ya tıklayın ve yazılımın plaka yükleme iletişim kutusunu istemesini bekleyin. Çift damıtılmış suyu, herhangi bir doku hasarını veya kurumasını önleyerek, önceden işlenmiş dokuları içeren kuyucuklardan dikkatlice çıkarın. Dokuları içeren oyuklara 200 mikrolitre ortaya çıkarma çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Test edilecek plakayı taşıyıcıya yerleştirin ve algılamaya başlayın.