JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 5:13 dk. • July 8th, 2025
Fare dendritik hücreleri veya alloantijenleri veya kendi kendine antijenlerin genetik varyantlarını taşıyan DC'leri içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.
Yabancı antijenleri tanırken, kendi antijenlerine reaktif olmayan alloreaktif T hücreleri de dahil olmak üzere fare T hücrelerini tanıtın.
Alloreaktif T hücreleri bu alloantijenleri tanır ve DC'lerle etkileşime girerek F-aktin yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini tetikler.
Bu, T hücreleri üzerindeki reseptörlerin, DC'ler üzerindeki ko-uyarıcı moleküllerle etkileşime girmesini ve hücresel bir bağlantı - immünolojik bir sinaps oluşturmasını teşvik eder.
Hücreleri sabitleyin, bir tüpe aktarın ve T hücresi ve DC reseptörlerine özgü florokrom etiketli antikorlardan oluşan bir kokteyl ekleyin ve farklı floresan verin.
Bağlanmamış antikorları çıkarın ve hücreleri, hücrelere nüfuz eden geçirgenleştirici bir ajan ve F-aktin'e bağlanan yeşil florofor etiketli protein belirteçleri içeren bir tamponda yeniden süspanse edin.
Hücreleri nükleer boya içeren bir tamponda santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin, çekirdekleri kırmızıya boyayın.
Görüntüleme akış sitometrisini kullanarak, sinaps oluşumunu doğrulayan yeşil artı F-aktin ile T hücresi ve DC konjugatlarına karşılık gelen çiftleri tanımlayın.
Alloreaktivite derecesini temsil eden çiftleri nicelleştirin.
96 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna 0.5 kez 10 ila altıncı dendritik hücrelere tohumlayarak başlayın, ardından kuyucuk başına toplam 50 mikrolitreye kadar kültür ortamının son hacminde altıncı T hücrelerine 1 kez 10 kez ekin. Soğuk kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dört saat inkübe edin.
Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her bir oyuğa PBS'deki% 1.5 formaldehitin kültür hacminin üç katını ekleyin. Fiksasyonun sonunda, hücreleri her bir oyuktan karşılık gelen 5 mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın ve hücreleri, ışıktan korunarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 mikrolitre yıkama tamponunda uygun florokrom konjuge antikorlarla boyayın.
Daha sonra, hücreleri 1 mililitre yıkama tamponunda yıkayın ve peletleri phalloidin-FITC içeren perma yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Işıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika daha sonra, hücreleri 1 mililitre taze perma yıkama tamponunda yıkayın. Işıktan korunan oda sıcaklığında son 30 dakikalık bir inkübasyon için perma yıkama tamponunda ilgilenilen nükleer boyadaki peletleri yeniden süspanse edin ve hücreleri 1 mililitre perma yıkama tamponunda yıkayın, ardından tek başına yıkama tamponunda bir yıkama yapın. Daha sonra, hücreleri 50 ila 100 mikrolitre taze yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri küçük kapaklı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
Hücreden hücreye etkileşimleri analiz etmek için önce parlak alan görüntü elde etmek için bir kanal ayırın ve ilk kontrol tüpünü yükleyin. Parlak alan kanalı kapalıyken, Çalışma Alanı penceresinde, alan üzerinde en boy oranıyla kullanılan her kanal için yeni bir dağılım grafiği oluşturun ve en boy oranının bire yakın olduğu tekilleri kapatın.
Her florokrom için pozitif popülasyonu kontrol edin ve aydınlatma kutusundaki lazer voltajını gerektiği gibi ayarlayın. Kanallar kutusunda, boyamada kullanılan florokromlar için uygun kanalları seçin. Ardından, Kaydet'i tıklayın. Olay sayısı belirtilen eşiğe ulaştığında, alım otomatik olarak durdurulur.
Tüm tek leke kontrolleri elde edildikten sonra, ilk deneysel numune tüpünü yükleyin ve parlak alan kanalı da dahil olmak üzere uygun analiz kanalları altında on binlerce olay elde edin.