Mikobakterilere Karşı Test Bileşiği Aktivitesini Değerlendirmek için Bir Kömür Agar Resazurin Testi

Mikobakteri içeren çok kuyulu bir plaka alın. Kuyucuklara artan test bileşiği konsantrasyonları ekleyin.

Kuluçkaya yatmak. Bileşiğin Mikobakteriler üzerindeki etkisine bağlı olarak, bakteriyostatik bir aktivite göstererek mikobakteri büyümesini inhibe edebilir veya bakterisidal aktivite gösteren Mikobakterileri ortadan kaldırabilir.

Kuyu alikotlarını, test bileşiğini emmek ve taşınma etkilerini önlemek için aktif kömür içeren agar içeren bir kömür agar resazurin testine veya CARA'ya aktarın.

Kuluçkaya yatmak. Bileşiğin bakteriyostatik aktivitesi mikobakteriyel replikasyonu inhibe ederken, bakterisidal aktivite mikobakteriyel canlılığı azaltır.

Kuyucuklardaki resazurini dağıtmak için tampon, resazurin ve iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ekleyin.

Metabolik olarak aktif Mikobakterilerde, dehidrojenazlar mavi renkli, zayıf floresan resazurini pembe, floresan bir resorufin'e indirger.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, kuyucuklardaki resorufin floresansını ölçün.

Resorufin floresansı olmayan kuyular, bileşiğin bakterisidal aktivitesini gösterir.

Kuyucuklar arasında değişen floresan yoğunluğu, test bileşiklerinin konsantrasyona bağlı bakterisidal veya bakteriyostatik gücünü yansıtan canlı bakteri yükünü gösterir.

Sırasıyla 4 veya 20 mililitre Middlebrook 7H9-ADN veya 7H9-OADC içeren polipropilen yuvarlak tabanlı veya konik santrifüj tüplerini M. smegmatis ile 0.01 ila 0.1 arasında bir OD_580'de aşılayın. M. smegmatis kültürlerini 37 santigrat derece ve% 20_O2'de çalkalanarak inkübe edin, kültürleri orta log fazına veya yaklaşık 0.5 OD_580'e genişletin.

Replikasyon ve replike olmayan koşullar altında minimal bir inhibitör konsantrasyon tarzı deneyi kurmak için, 7H9-ADN'de 200 mikrolitre hücreyi 0.01'lik bir OD_580'de açık tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın tüm kuyucuklarına dağıtın.

Replike etmeyen tahlil için, hücreleri iki kez yıkamak için% 0.02 tyloxapol içeren PBS kullanın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için replike olmayan ortam kullanın. Hücreleri 0.1'lik bir OD_580'e seyreltmek için çoğalmayan ortam kullanın ve taze hazırlanmış 1 molar stoktan 0.5 ila 5 milimolar nihai konsantrasyona sodyum nitrit ekleyin.

0.1'lik bir OD_580'de 200 mikrolitre hücreyi, şeffaf tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın tüm oyuklarına dağıtın. Test ajanlarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, A'dan E'ye kadar olan sıralara 2 mikrolitre test ajanı #1 ve E'den H'ye kadar olan sıralara 2 mikrolitre test ajanı #2 ekleyin ve iyice karıştırın.

Tahlilleri tekrarlamak için, M. smegmatis mikroplakalarını 37 santigrat derece,% 20_O2 ve% 5 CO_2'de 1 ila 48 saat inkübe edin. CARA'nın okuma olarak kullanılacağı zaman noktalarında, MIC90 tarzı tahlil plakasının kuyu içeriğini 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice yeniden süspanse etmek için 50 ila 75 mikrolitreye ayarlanmış bir P200 çok kanallı pipet kullanın. Ardından, kuyucukların içeriğini dairesel hareketlerle hafifçe döndürmek için pipet uçlarını kullanın.

Seyreltilmemiş tahlil kuyusu içeriğinin 10 mikrolitresini CARA mikroplakasının ilgili kuyucuklarına aktarın, transferler sırasında sıçramayı önleyin ve 10 mikrolitrelik alikotun CARA mikroplaka kuyucuklarının ortasına yerleşmesini sağlayın. Plaka bandı ile CARA mikro plaka yığınlarını bağlayın ve ardından bunları yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun. M. smegmatis CARA mikroplakalarını% 20 O₂ ile% 37 santigrat derecede çoğaltan plakalar için bir ila iki gün ve çoğalmayan plakalar için iki ila üç gün inkübe edin.

Negatif kontrol kuyucuklarında bir bakteri üremesi filmi veya daha büyük makroskopik koloniler görüldüğünde, kuyucukların kenarı boyunca 40 mikrolitre steril PBS dağıtmak için çok kanallı bir pipetle tek bir 12 P200 uç seti kullanın ve PBS'nin agar bakteri mikrokolonilerinin tepesine dağılmasına izin verin.

PBS'de 5 miligram resazurin ve 50 mililitre% 5 Tween-80'i karıştırarak CARA geliştirme reaktifini hazırlayın. CARA mikroplakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre taze hazırlanmış CARA geliştirme reaktifi ekleyin. Ardından, reaktifi her bir oyuktaki agar ve bakteri matı boyunca dağıtmaya yardımcı olmak için plakaları birkaç kez ileri geri sallayın. Plakaları yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun ve M. smegmatis için en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Floresan okumadan önce, CARA mikroplakalarını, kapakları çıkarılmış olarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir biyogüvenlik başlığına yerleştirin. BSL3 spektrofotometrelerini bir biyogüvenlik kabininin dışında kullanırken, plakanın üzerine optik kalitede bir PCR etiketi yapıştırın ve etiket yüzeyine hafifçe bastırarak sıkıca kapatmak için yumuşak bir kağıt havlu kullanın. 530 nanometrede uyarma ve 590 nanometrede emisyon ile üstten okuma yoluyla floresansı belirleyin.