TNFa'ya Karşı Antikorların Anti-Apoptotik Aktivitesini Belirlemek için İn Vitro Bir Yöntem

Serumdan yoksun ortamda fare fibroblastları içeren çok kuyulu bir plaka alın. TNFa'ya özgü antikorların seri dilüsyonlarını ekleyin.

İnflamatuar bir sitokin olan TNFα ekleyin.

Kuluçkaya yatmak. Serum yoksunluğu hücresel strese neden olur ve hücreleri TNFα aracılı apoptoza duyarlı hale getirir.

Serumdan yoksun hücreler üzerindeki reseptörlerine TNFα bağlanması, hücre içi sinyal kaskadlarını tetikleyerek kaskadı aktive eder ve apoptozu indükler.

Bununla birlikte, TNFa'ya antikor bağlanması, kaspaz aktivasyonunu inhibe ederek reseptör bağlanmasını önler.

İnkübasyon sonrası, ATP ve magnezyum iyonları ile birlikte deterjan, prolüminesan kaspaz substratı ve bir lusiferaz enzimi içeren bir reaktif karışımı ekleyin. Karıştırın ve inkübe edin.

Deterjan, zarlara nüfuz ederek TNFa'nın neden olduğu hücrelerden kaspazları serbest bırakır.

Biyolüminesan substrat, bir kaspaz tanıma bölgesi içerir. Spesifik kaspazlar substratı parçalayarak aminolusiferin üretir.

Lusiferaz, substratı olan aminolusiferini oksitleyerek ışık emisyonuna neden olur.

TNFα'yı nötralize etmek ve TNFα'nın neden olduğu apoptozu önlemek için TNFα spesifik antikorlarının gücünü gösteren, artan antikor konsantrasyonları ile lüminesansta bir düşüşü tespit etmek için lüminesans yoğunluğunu ölçün.

Tahlil plakasının iç 60 kuyusuna, sütun 2'den 11'inci sütuna kadar 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Mikroplakaya alikotlar eklemek için hücre süspansiyonunu pipetleme ile karıştırın. Hemen, eşlenen seyreltmelerin 50 mikrolitresini tahlil plakasına aktarın.

Paralel şeritler için, mikropipetin etrafında çevirerek seyreltmeleri dağıtın. Haritalanan seyreltmeler, aşağıdaki sırayla kuyucuklara dağıtılabilir. Kontroller çevredeki kuyularda dağıtılır.

TNF-alfa'yı 500 mikrolitre ultra saf su ile seyreltin. 2.200 RPM'de vorteks karıştırıcı ile karıştırın. 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve son olarak tahlil kültürü ortamı ile mL başına 40 nanograma seyreltin. 50 mikrolitre apoptoz indüksiyon solüsyonunu 60 iç dış kuyucuğa dağıtın. Apoptoz indüksiyon çözeltisinin mikrolitrelerini 60 dahili tahlil kuyusuna dağıtın. Son olarak, 16 saat kuluçkaya yatırın.

Beşinci günde, alt tabakayı üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi tampon çözeltisiyle sulandırın. Beş kez ters çevirerek karıştırın. Substrat çözeltisini dağıtın ve tahlil plakasındaki her numune kuyucuğuna 50 mikrolitre substrat çözeltisi ekleyin. Ayrıca, kontrollere alt tabaka ekleyin. Tahlili bir vorteks karıştırıcıda 400 RPM'de üç dakika çalkalayın.

Tahlil plakasını mikserden çıkarın ve oda sıcaklığında inkübe edin. Bir plaka okuyucu spektrofotometresini açın. Softmax Pro yazılımını veya eşdeğer bir programı açın. Mikroplakayı spektrofotometreye yükleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın.

Teçhizat tipindeki lüminesans işlevini uç nokta işlevine etkinleştirin. Teçhizat alanını sütun 1 ve 12 hariç tutun. Plaka tipini 96 oyuklu standart şeffaf tabanlı bir mikroplakaya seçin. Entegrasyon süresini 1250 milisaniyeye kadar değiştirin. Mikroplakanın sallanma süresini 10 saniyeye ayarlayın. Referans maddenin, analitik maddenin ve kontrol numunesinin yerleştirileceği duvarı seçin. Okumaya başla.