Lenfosit Proliferasyonunu İndüklemek için Aşı Darbeli Dendritik Hücre Bazlı İn Vitro Test

Test aşısı antijenlerini dendritik hücre kültürüne ekleyerek başlayın.

Dendritik hücre antijeni tanır, reseptör aracılı endositoz yoluyla içselleştirir, daha küçük peptitlere parçalar ve elde edilen antijen-MHC kompleksini sunum için hücre yüzeyine aktarır.

T hücresi reseptörü ile antijen-MHC kompleksi ve bunların ko-reseptörleri arasındaki etkileşimi sağlamak için antijen sunan dendritik hücreleri naif T lenfositlerle birlikte kültürleyin.

Bu, hücre içi sinyalleme yoluyla T lenfositlerini aktive eden immünolojik sinaps oluşumuna yol açar.

Aktive edilmiş T lenfositler, efektör T lenfositleri üreten klonal genişlemeye uğrar.

Kültüre interlökin-2 veya IL-2 sitokin molekülleri ekleyin ve inkübe edin. IL-2'nin bağlanması, hücre içi sinyalleşmeyi tetikleyerek lenfositlerin çoğalmasını ve hayatta kalmasını sağlar.

Kültür ve santrifüjden küçük bir hacim alın. Süpernatanı atın. Hücre peletini antijen sunan dendritik hücrelerle yeniden süspanse edin ve aynı kuyuya aktarın.

Antijen ile yeniden uyarılma lenfosit proliferasyonunu arttırır.

Lenfosit proliferasyonu ile ilişkili spesifik belirteçleri ölçmek için aşağı akış analizi yapın.

Antijen darbeli MoDC'ler oluşturmak için, 24 oyuklu plakadaki 1 mililitre saf MoDC kültürüne mililitre kuduz virüsü aşısı veya RV süspansiyonu başına 1 mikrolitre ekleyin ve plakayı %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. Yedinci günde, oyuk başına 1 mililitre buz gibi soğuk PBS eklemeden ve iyice karıştırmadan önce, antijen darbeli MoDC'leri içeren 24 oyuklu plakayı 10 dakika buz üzerinde tutun. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Kuyuları 2 mililitre buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Her bir oyuktaki artık hücreleri toplayın ve yıkanan içeriği ilgili tüplerine aktarın. Hücre süspansiyonunu 500 g'da 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra, mililitre başına 100.000 hücrenin nihai konsantrasyonunu ayarlamak için antijen darbeli MoDC hücre peletini tam bir kültür ortamında yeniden süspanse edin.

MoDC lenfosit ko-kültürü için, antijen darbesinin yedinci gününde 1 mililitre saf lenfosit hücre süspansiyonu ve 1 mililitre antijen darbeli veya antijen darbeli olmayan MoDC süspansiyonu ile steril 24 oyuklu bir plakanın kuyularını tohumlayın. İki günlük inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğu mililitre rekombinant interlökin-2 başına 20 nanogram ile destekleyin ve inkübasyona 120 saat daha devam edin.

14. günde, 1 mililitre ko-kültürü steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü santrifüjleyin. Daha sonra, hücre peletini 1 mililitre antijen darbeli veya darbesiz MoDC ile yeniden süspanse edin. İyice karıştırın ve hücre süspansiyonlarını karşılık gelen kuyucuklarına aktarın.

PBMC'lerin ve saf lenfositlerin ve monositlerin hücre yüzeyi boyanmasından sonra, hücre süspansiyonunun 1 mililitresini bir pipet kullanarak steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 500 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, peleti 1 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ayrıca, 1 mililitre PBS kullanarak artık hücreleri ve karşılık gelen tüpleri toplayın. Daha sonra hücrelerin bulunduğu 15 mililitrelik tüpe 10 mililitre PBS ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.

Tüpü 850 g'da 7 dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve süpernatanı boşalttıktan sonra kalan süspansiyon ile hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve dökülmeyi önlemek için kuyucukları kapatın.

Boyama tamamlandıktan sonra akış sitometresi analizini gerçekleştirin. Gerçek zamanlı önizlemeden, voltaj, kazanç ve hücre boyutu dahil olmak üzere floresan eşiğini ayarlayın ve sonunda istenen hücre popülasyonunun etrafına kapılar çizerken, herhangi bir hücresel kalıntıyı hariç tutun.