Tek Bir Hücreden Protein Salgılarını Tespit Etmek için Lokalize Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme

Karboksil grupları içeren kendi kendine monte edilmiş tek katmanlı işlevselleştirilmiş altın nanoyapılı diziler içeren bir cam sensör çipi ile başlayın.

Çipi bir mikroakışkan düzeneği içine sabitleyin ve karboksil gruplarını aktive etmek için bir bağlayıcı yerleştirin.

Bağlayıcılar aracılığıyla aktive edilmiş karboksil grupları ile konjuge olan peptit ligandları ekleyin.

Deaktivatör bileşik içeren bir tampon ile muamele edin, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini devre dışı bırakın ve bir tamponla yıkayın.

Polarize bir ışığı çipin üzerine odaklayın. Lokalize bir yüzey plazmon rezonans görüntüleme sistemi kullanarak, karanlık bir arka plana karşı parlak kareler olarak görünen dizilerin bir görüntüsünü elde edin.

Rezonans açısında altın elektronlar ışığı emer. Sensör yanıtını oluşturmak için yansıyan ışık yoğunluğunu ilgili açıda ölçün.

Çipe bağlanan ve yıkanan protein salgılayan hibridoma hücrelerini tanıtın.

Bağlı hücreler, yakındaki dizideki ligandlarla etkileşime giren proteinleri salgılar.

Bu etkileşimler, yansıyan ışığın açısını ve yoğunluğunu değiştirerek, sensör tepkisinde bir değişikliğe neden olarak hücrelerin salgı aktivitesini doğrular.

Lokalize yüzey plazmon rezonansını veya LSPR yongalarını temizlemek ve yenilemek için, 45 saniye boyunca% 5 hidrojen ve% 95 argon içeren 300 mililitrelik bir karışımda 40 watt gücünde plazma külü. Çipi 3'e 1 oranında SPO ve SPC'den oluşan iki bileşenli bir etanolik tiyol çözeltisine batırarak plazma küllemeden hemen sonra altın yüzeyi ve nanoyapıları işlevsel hale getirin. Çipi, kendi kendine monte edilmiş bir tek tabaka oluşturmak için gece boyunca tiyol çözeltisinde bıraktıktan sonra, etanol ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın.

Çipi alüminyum bir alt parçaya yerleştirerek LSPR çipini özel yapım bir mikroakışkan tutucuya yükleyin. Ardından, tertibatı sıkıştırmak için dört vida kullanarak çipi bu alt parça ile bir silikon conta ve şeffaf plastik bir üst parça arasına sıkıştırın.

Tipik bir SPC bazlı tiyol uygulaması için, SPC tiyol bileşeninin karboksil gruplarını aktive etmek için deiyonize damıtılmış suda 133 milimolar EDC ve 33 milimolar NHS'nin 1'e 1 karışımından 300 mikrolitre damlatın. 10 dakika bekledikten sonra yüzeyi 10 milimolar PBS ile manuel olarak durulayın.

Bunu takiben, aktive edilmiş karboksil grubunu, ligand çözeltisinin 300 mikrolitresini damla ile kaplayarak ilgilenilen ligand ile konjuge edin. 1 saat bekledikten ve yüzeyi 10 milimolar PBS ile duruladıktan sonra, spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için çip üzerinde PBS'de 300 mikrolitre 0.1 molar etanolamin damlatın. 10 dakika bekledikten sonra etanolamini %0.005 Tween 20 veya PBS-T20 içeren PBS ile yıkayın.

Ardından, değişen bir menisküsle ilgili verilerdeki dalgalanmaları azaltmak için çipin üzerine bir kuvars parçası yerleştirin. Mikroskoba monte ederken çipi PBS-T20 tamponu ile ıslak tutun. Mikroakışkan boruyu düzeneğe ve sabit bir duruma ulaşılana kadar akış tamponuna takın. Ardından, LSPR uç tertibatını ısıtılmış s'ye sıkıca yerleştirin.amp numune tutucusu.

Bu yöntem için optik kurulum burada gösterilmiştir. Halojen lambadan gelen ışık, nanoplazmonik tepkiye katkıda bulunmayan dalga boylarını ortadan kaldırmak için 593 nanometre uzunluğundaki bir geçiş filtresinden geçirilir. Işık daha sonra doğrusal olarak polarize edilir ve numune, plazmonik altın nanoyapıların uyarılması için 40x 1.4 sayısal açıklık objektifi ile aydınlatılır. Saçılan ışık, objektif tarafından toplanır ve cam alt tabakadan gelen arka plan sinyalini azaltmak için çapraz bir polarizörden geçirilir. Eşzamanlı spektroskopik ve görüntü analizi için toplanan ışık yoluna 50/50'lik bir ışın ayırıcı yerleştirilir.

Düzeneğin ve mikroskobun en az iki saat dengelenmesine izin verdikten sonra, merkezi dizi spektroskopi için fiber optik ile hizalanacak şekilde joystick'i kullanarak çipi hizalayın. Hibridoma hücrelerini santrifüjleme ile kültürledikten ve peletledikten sonra, onları hasat edin. Ardından, bunları LSPR yongalarına takmadan önce canlılığını test edin. Bunu takiben, 50 mikrolitre hücre solüsyonunu bir mikropipet ile LSPR çiplerine manuel olarak verin. Son olarak, LSPR çiplerini görüntülemeye hazırlamak için bir mikroakışkan perfüzyon sistemi kullanarak çözelti içinde kalan hücreleri taze serumsuz ortamla yıkayın.