Virüsler Arasındaki Antijenik İlişkinin Görüntü Tabanlı Mikronötralizasyon Testi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Memeli hücre tek katmanlarına ortam ve seri olarak seyreltilmiş reseptör yok edici enzimle muamele edilmiş antiserumlar ekleyerek spesifik olmayan virüs bağlanmasını önleyin.

Bir grip virüsü süspansiyonu ekleyin. Viral proteinlere özgü antiserum antikorları bağlanır, virüsleri nötralize eder ve hücresel girişi önler.

Düşük nötralize edici antikor konsantrasyonu veya nötralize edici olmayan antikorlar, virüsün hücre reseptörlerine bağlanmasına izin vererek etkisiz viral antijen bağlanmasını sağlar.

Medyayı atın. Selüloz içeren ortamı uygulayın, yarı katı bir kaplama oluşturun.

Virüs, viral parçacıklar oluşturmak ve hücre lizizine neden olmak için konak hücre makinesini kullanır.

Kaplama, virüs hareketini kısıtlar, lokalize enfeksiyonu kolaylaştırır ve hücre tek katmanlarında delikler oluşturur.

Kaplamayı çıkarın. Hücreleri düzeltin ve geçirgenleştirin.

Tampon ile yıkayınız. Geçirgen hücreler içinde viral antijenleri bağlayan antikorlar ekleyin.

Pipet yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorlar, birincil antikorlara bağlanır.

Peroksidaz substratlarını ve hidrojen peroksiti ekleyin, bu da mavi bir ürün elde edilmesini sağlar.

Antiserum dilüsyonlarına karşı virüsle enfekte hücre popülasyonlarını ölçmek için görüntü kuyuları.

Nötralizasyon titrelerini belirlemek için enfekte olmuş bir hücre popülasyonunda belirli bir azalmayı gösteren antiserum seyreltmelerini tanımlayın.

Virüs nötralizasyonunu gerçekleştirmek için, hücre tek tabakasını iki veya üç gün önceden hazırlayın, ardından plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre VGM ekleyin. Virüs kontrolü ve hücre kontrolü için sırasıyla 11 ve 12 numaralı sütunları kullanın. 1 ila 10 arasındaki sütunların ilk sırasına 20'de 1 oranında reseptör yok edici enzim veya RDE ile muamele edilmiş serumun 50 mikrolitrelik alikotlarını ekleyin.

50 mikrolitreyi A satırından H satırına aktararak ve 50 mikrolitreyi H satırından atarak iki katlı seri seyreltme gerçekleştirin. Ardından, hücre kontrol kolonunun her bir oyuğuna 50 mikrolitre seyreltici ekleyin. Hücre kontrol sütunu hariç, plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre virüs ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede iki ila üç saat inkübe edin. Ardından, aşıyı çıkarın ve kaplamayı her bir oyuğa ekleyin. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede rahatsız edilmeden inkübe edin. Ardından plakaları sabitleyin ve boyayın.

Nötralizasyonu ölçmek için, düz yataklı bir tarayıcının tarama alanına bir kuyu plakası yerleştirin. Plakayı tarayın ve gerekli viral titreleri hesaplamak için kuyu plakası okuyucu yazılımını çalıştırın.