Memeli Hücrelerinde Toplu Otofajik Sekestrasyon Aktivitesinin Ölçülmesi

Toplu otofaji, otofajik yükün ve laktat dehidrojenaz veya LDH dahil olmak üzere çözünür sitozolik proteinlerin bozunma için otofagozomlar içinde tecrit edilmesini içerir.

Toplu otofajik aktiviteyi yansıtan LDH sekestrasyonunu değerlendirmek için, otofajik-lizozomal bozulmayı bloke etmek için inhibitörlerle tedavi edilmiş, besin açlığı çeken hücrelerle bir elektroporasyon küveti alın.

Hücre zarını seçici olarak bozmak ve çözünür proteinleri serbest bırakmak için elektroporasyon gerçekleştirin.

Hücresel bileşenleri korumak için hücre bozucusunu tamponlu sükroz çözeltisi ile karıştırın.

Gerekli seyreltilmiş bozucu çözeltiyi tampon içeren bir tüpe aktarın. Sekestre edilmemiş LDH'yi otofagozom ile tecrit edilmiş LDH'den ayırmak için santrifüjleyin.

Toplam hücresel LDH fraksiyonunu içeren kalan seyreltilmiş disruptate çözeltisini başka bir tüpe aktarın.

Ayrılmış ve toplam LDH fraksiyonlarını çıkarmak için her iki tüpe iyonik olmayan yüzey aktif madde içeren bir tampon ekleyin.

LDH içeren süpernatanları santrifüjleyin ve piruvat ve NADH ile tampon içeren tüplere aktarın.

LDH, piruvatı NADH oksidasyonu ile laktata dönüştürür ve LDH konsantrasyonu ile ilişkili NADH seviyelerini azaltır.

LDH sekestrasyonunu belirlemek için sedimantlı ve toplam hücresel fraksiyonlarda LDH'yi ölçün.

Bir pipet kullanarak, neredeyse tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre peletini yeniden süspanse edin. Bu süspansiyonu 4 milimetrelik bir elektroporasyon küvetine aktarın. Küveti üstel bozunma dalgası elektroporatörüne yerleştirin ve 800 volt, 25 mikrofarad ve 400 ohm'da tek bir elektrik darbesini boşaltın.

Hücreyi bozarak 400 mikrolitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu sükroz çözeltisi içeren 1,5 milimetrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın ve pipetleme ile kısa bir süre karıştırın. Her numune için bu yeniden süspansiyonu, elektrot bozulmasını ve karıştırma işlemini tekrarlayın. Prosedürü ilk kez gerçekleştiriyorsanız, metinde açıklandığı gibi verimli ve seçici plazma membran elektrot bozulmasını doğruladığınızdan emin olun.

Çökeltilmiş LDH fraksiyonları elde etmek için, seyreltilmiş hücre tarafından bozulmuş her çözeltiden 550 mikrolitre çıkarın ve bunu% 0.5 BSA ve% 0.01 Tween-20 ile 900 mikrolitre buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu içeren kendi 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Karıştırmak için kısa bir süre pipetleyin. Sedimantlı LDH içeren peletler üretmek için 45 dakika boyunca 18.000 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Emme kullanarak, peletleri mümkün olduğunca kuru bırakmak için süpernatanı iyice aspire edin.

Çökelmiş LDH örneklerini analiz etmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Toplam LDH fraksiyonları için, seyreltilmiş hücre parçalanmış çözeltilerin her birinden 150 mikrolitreyi kendi yeni tüpüne aktarın. Bunları analiz etmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın.

Hem çökelmiş LDH'yi hem de toplam LDH örneklerini buz üzerinde çözün. Çözüldükten sonra, toplam LDH numunelerine %1,5 Triton X-405 içeren 300 mikrolitre buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu ekleyin. Numuneleri soğuk bir odada bir rulo üzerinde 30 dakika döndürün. Daha sonra, çökelmiş LDH numunelerine %1 Triton X-405 içeren 750 mikrolitre buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu ekleyin. Çözelti homojen olana kadar peletleri yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın. Çözünmemiş hücresel kalıntıları çökeltmek için tüm numuneleri 4 santigrat derecede 18.000 kez g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjleme tamamlandıktan sonra numuneleri buzun üzerine koyun. Metinde açıklandığı gibi klasik bir enzimatik test veya ticari olarak temin edilebilen çok çeşitli kitlerden herhangi birini kullanarak süpernatanlardaki LDH seviyelerini belirleyin.