JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:33 dk. • July 8th, 2025
Toplu otofaji, otofajik yükün ve laktat dehidrojenaz veya LDH dahil olmak üzere çözünür sitozolik proteinlerin bozunma için otofagozomlar içinde tecrit edilmesini içerir.
Toplu otofajik aktiviteyi yansıtan LDH sekestrasyonunu değerlendirmek için, otofajik-lizozomal bozulmayı bloke etmek için inhibitörlerle tedavi edilmiş, besin açlığı çeken hücrelerle bir elektroporasyon küveti alın.
Hücre zarını seçici olarak bozmak ve çözünür proteinleri serbest bırakmak için elektroporasyon gerçekleştirin.
Hücresel bileşenleri korumak için hücre bozucusunu tamponlu sükroz çözeltisi ile karıştırın.
Gerekli seyreltilmiş bozucu çözeltiyi tampon içeren bir tüpe aktarın. Sekestre edilmemiş LDH'yi otofagozom ile tecrit edilmiş LDH'den ayırmak için santrifüjleyin.
Toplam hücresel LDH fraksiyonunu içeren kalan seyreltilmiş disruptate çözeltisini başka bir tüpe aktarın.
Ayrılmış ve toplam LDH fraksiyonlarını çıkarmak için her iki tüpe iyonik olmayan yüzey aktif madde içeren bir tampon ekleyin.
LDH içeren süpernatanları santrifüjleyin ve piruvat ve NADH ile tampon içeren tüplere aktarın.
LDH, piruvatı NADH oksidasyonu ile laktata dönüştürür ve LDH konsantrasyonu ile ilişkili NADH seviyelerini azaltır.
LDH
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin