JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:53 dk. • July 8th, 2025
Salgılanan embriyonik alkalin fosfataz veya SEAP genini veya indüklenebilir promotörler altında salgılanan bir lusiferaz genini barındıran farklı raportör makrofajlara sahip çok kuyulu bir plaka alın.
Belirlenen kuyucuklara lipopolisakkaritler veya LPS ile karıştırılmış farklı peptit-altın nanopartikül hibritleri içeren ortam ekleyin.
LPS, makrofaj toll benzeri reseptörlere veya TLR'ye bağlanarak endozoma içselleştirmeyi tetikler.
Endozomal proton pompası protonları içeriye taşır. Asitleşme, transkripsiyon faktörlerini aktive ederek TLR sinyalini tetikler.
Bu faktörler, SEAP veya lusiferaz üreten raportör genlerin ekspresyonunu indükler.
Alternatif olarak, LPS'nin hibritlerle birlikte içselleştirilmesi, negatif yüklü peptit gruplarının luminal protonları tecrit etmesine, endozomal asitleşmeyi önlemesine ve TLR sinyalini inhibe etmesine neden olur.
Ortamı toplayın, süpernatanı ayırmak için santrifüjleyin ve SEAP ve lusiferaz için substratlar ekleyin.
SEAP, alt tabakasını renkli bir ürüne dönüştürürken, lusiferaz, lüminesans üretmek için alt tabakasını katalize eder.
Raportör sinyallerinde bir azalma, hibritlerin TLR sinyal inhibisyonundaki etkinliğini gösterir.
1.5 mililitrelik eppendorf tüplerinde 20 hacim peptid-GNP hibrit çözeltisini 30 dakika boyunca 18.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları dikkatlice atın. Melezleri tek bir taze tüpe aktarın ve 1 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Bundan sonra, yıkanmış hibritleri bir hacim R10 ortamında yeniden süspanse edin. Konsantre hibritlerin ve LPS içeren R10 ortamının eşit hacimlerini, hibritlerin ve LPS'nin nihai konsantrasyonu sırasıyla mililitre başına 100 yüz nanomolar ve 10 nanogram olacak şekilde karıştırın.
Ardından, kültür ortamını makrofaj kültür plakasından çıkarın. Her koşul için üç kopya ile her bir oyuğa 100 mikrolitre hibrit-LPS karışımı ekleyin. Bir negatif kontrol ve bir LPS kontrolü ekleyin. 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin, ardından her bir oyuğun ortamını ayrı bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede 18.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanları 96 oyuklu yeni bir yuvarlak alt plakaya aktarın.
Bu numuneler üzerinde raportör tahliline başlamak için, yeni bir 96 oyuklu düz tabanlı plakanın her bir oyuğuna 180 mikrolitre önceden ısıtılmış QUANTI-Blue çözeltisi ekleyin, ardından her numuneden 20 mikrolitre süpernatantı bu plakaya aktarın. Koyu mavi renk 1'in üzerinde bir optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin. Bundan sonra, emilimi 655 nanometrede kaydetmek için bir plaka okuyucu kullanın. Ardından, her numuneden 10 mikrolitre taze süpernatanı 96 kuyucuklu şeffaf düz tabanlı beyaz bir tabağa aktarın.
Otomatik bir enjektör kullanarak, her bir oyuğa 50 mikrolitre lusiferaz çözeltisi ekleyin ve lüminesansı hemen iyi bir şekilde kaydedin. Ardından, potansiyel adayların engelleyici etkisini doğrulayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi TLR özgüllüğünü değerlendirin.