Enfekte Bir Farenin Organlarındaki Virüs Titrelerini Ölçmek için Odak Oluşturan Bir Test

Tek katmanlı memeli hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Kuyucukları, enfekte bir farenin farklı organlarından türetilen Zika virüsünü içeren doku homojenatlarının seri seyreltmeleri ile aşılayın.

Endositoz yoluyla hücrelere girdikten sonra, virüs çoğalır ve komşu hücreleri enfekte etmek için tomurcuklanır.

Virüs hareketini kısıtlayan fiziksel bir bariyer oluşturarak yüksek viskoziteli bir metilselüloz çözeltisi ile kaplayın.

Bariyer sadece hemen komşu hücrelerin enfeksiyonuna izin verir, enfekte olmuş hücrelerin odaklarını oluşturur ve her odağın tek bir virüs partikülünden kaynaklanmasını sağlayarak doğru miktar tayinini mümkün kılar.

Hücreleri sabitleyin ve zarı geçirgen hale getirin. Hücrelere giren ve viral antijen ile etkileşime giren birincil antikorları ekleyin.

Birincil antikora bağlanan peroksidaz konjuge bir ikincil antikor ekleyin.

Enfekte olmuş hücrelerin odaklarını gösteren renkli lekeler oluşturmak için peroksidaz tarafından dönüştürülen kromojenik bir substrat ekleyin.

Farenin farklı organlarındaki virüs titresini ölçmek için odakları sayın.

Homojenize edilmiş numuneleri eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve çözülmelerine izin verin. Numuneler buz üzerindeyken, Zika virüsünü seyreltme plakasının ilk oyuğuna 10 kat seyreltin ve plakadan 10 kat seri seyreltme yapmak için çok kanallı bir pipet kullanın, her seferinde 180 mikrolitre büyüme ortamına 20 mikrolitre numune ekleyerek uçları değiştirin.

Her seyreltme arasında pipet uçlarını değiştirin. Vero hücrelerini kaplayan hazırlanan düz tabanlı 96 oyuklu plakadan ortamı çıkararak odak oluşturan plakayı hazırlayın. Tek tabakanın kurumasını önlemek için, Vero plakasındaki her bir oyuğa hemen 100 mikrolitre virüs seyreltmesi ekleyin. En düşükten en yükseğe doğru eklemek için aynı ipucu setini kullanın.

Kaya plakaları 2 ila 4 kez yan yana koyun ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir ila iki saat inkübe edin. % 2 metilselülozu oda sıcaklığına ısıtın. Ardından, %2'lik metilselüloz çözeltisini büyüme ortamında yaklaşık 2'ye 1 oranında seyreltin. İnkübasyondan sonra, 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 125 mikrolitre metilselüloz büyüme ortamı ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 32 ila 40 saat boyunca tekrar inkübe edin.

Vero hücrelerini bir biyogüvenlik kabinine sabitlemek için, 96 oyuklu plakaların her bir oyuğundaki metilselüloz tabakasının üstüne 50 mikrolitre %5 paraformaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. Alternatif olarak, plakaları parafilm ile örtün ve gece boyunca 4 santigrat dereceye yerleştirin.

Bundan sonra, hücrelerdeki kaplamayı ve ortamı biyogüvenlik kabininin içindeki tek kullanımlık bir kaba çıkarmak için bir pipet kullanın. Kuyucuk başına 150 mikrolitre PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi plakalardan çıkarın ve plakayı biyogüvenlik kabininden çıkarın. PBS yıkamasını iki kez tekrarlayın. Daha sonra, bir kez FFA yıkama tamponu için oyuk başına 150 mikrolitre ekleyin ve sabit hücrelere nüfuz etmesi için oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika bekletin.

Ardından, enfeksiyonu tespit etmek için birincil Zika antikorunu kullanın. Birincil antikor 4G2'yi FFA boyama tamponunda mililitre başına 1 mikrogram konsantrasyonda hazırlayın. FFA yıkama tamponunu plakalardan hafifçe vurun ve her bir oyuğa FFA boyama tamponunda 50 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Ardından, plakaları parafilm veya plastik film ile kapatın ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

İkincil keçi anti-fare HRP etiketli antikoru FFA boyama tamponunda 1 ila 5.000 konsantrasyonda hazırlayın. Antikor çözeltisini çıkardıktan sonra, hücreleri oyuk başına 150 mikrolitre FFA yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Her seferinde lavaboya hafifçe vurarak yıkama tamponunu çıkarın.

Hücreleri, oyuk başına 50 mikrolitrede FFA boyama tamponunda ikincil antikor ile boyayın ve oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin. Bundan sonra, hücreleri tekrar FFA yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve her seferinde lavaboya hafifçe vurarak yıkama tamponunu çıkarın.

Her kuyucuğa 50 mikrolitre Trueblue alt tabaka ekleyin. Noktalar minimum arka planla tam olarak tanımlanana kadar 2 ila 15 dakika bekleyin. Lekeler göründükten sonra, tek tabakayı akan suyun kuvvetinden korumak için bir elinizi kullanarak suyla nazikçe yıkayın. Kağıt havlularda muslukta kurulayın.

Kısa bir süre sonra, her bir kuyucuktaki noktaları manuel olarak saymak için bir diseksiyon dürbünü kullanın veya otomatik bir nokta sayacı kullanın. İmmünoyakalama yazılımında, her numune için oyuk başına 20 ila 200 arasında kolayca ayırt edilen odaklara sahip bir seyreltme seçin ve çift oyukların ortalamasını kullanarak mililitre başına odak oluşturan birimlerde titreyi hesaplayın.