JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:11 dk. • July 8th, 2025
Trombositten zengin plazma içeren çok kuyucuklu bir plaka ile başlayın. Trombositler, mekanik uyaranlara yanıt veren yüzey mekanoreseptör komplekslerini eksprese eder.
Mekanoreseptör kompleksi, mekanosensoriyel alana bağlı hücre dışı ligand bağlama alanını ve makro-glikopeptid bölgesini içerir.
Karşıt trombositler üzerindeki reseptörlerin ligand bağlama alanları ile çapraz bağlanan anti-mekanoreseptör antikorlarını tanıtın.
Viskozimetrenin düzenekleri arasına antikorla muamele edilmiş plazma süspansiyonunun bir damlasını yerleştirin.
Mekanik kuvveti simüle ederek, antikora bağlı reseptörleri trombositlerden uzaklaştırarak, mekanosensoriyel alandan makro-glikopeptid bölgesinin ayrışmasına yol açan kesme gerilimi uygulayın.
Bu, mekanosensoriyel alanda konformasyonel bir değişikliği tetikler, trombositleri aktive eder ve yüzey işaretleyicilerinin ekspresyonu ile sonuçlanır.
Kesilmiş trombosit süspansiyonunu çok kuyulu plaka içindeki yeni bir kuyuya aktarın.
Karşılık gelen trombosit yüzey belirteçleri ile etkileşime giren florofor etiketli işaretleyiciye özgü moleküllerden oluşan bir kokteyl ekleyin ve hücreleri fiksatif bir çözelti ile sabitleyin.
Akış sitometrisinde, farklı floresan sinyalleri, kayma stresinin antikorla tedavi edilen trombositler üzerindeki etkileri ile ilişkilidir.
Ligand tedavisi için, yavaşça, ilgilenilen antikoru veya ligandı trombositten zengin plazmaya ekleyin ve trombositleri hafifçe karıştırın. İnkübasyon sırasında, koni plaka viskozimetresini açın ve plaka sıcaklığını 22 santigrat dereceye ayarlayın. 5 ila 10 dakika sonra, tedavi edilmiş trombositten zengin plazmayı, numunenin tamamının temas noktasında koni ile plaka arasında birikmesine dikkat ederek, doğrudan plakanın merkezindeki sıcaklık kontrollü konik plaka viskozimetresine aktarın.
Numuneye kesme uygulamak için, kesmeyi viskozimetre kılavuzuna göre hesaplayın ve numuneye uygun oran ve sürede kesme uygulayın. Uygulamanın sonunda, numunenin hem plaka hem de koni ile temas halinde kalması için koniyi plakadan yaklaşık 2 milimetre kaldırın ve numune hacminin merkezinden 5 ila 10 mikrolitre toplamak için jel yüklemeli bir pipet ucu kullanın. Daha sonra, kesilmiş numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ilgilenilen yüzey belirteçlerine karşı antikorlarla inkübe edin ve numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 2 paraformaldehit içinde sabitleyin.
Numuneleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, her koşul için en az 20.000 olay toplayın ve her bir floroforun yoğunluğu için yükseklik değerini kullanarak her bir floresan işaretleyicinin sinyal gücünü ölçün. Ardından, negatif arka plan floresan olaylarını hariç tutan bir kapı çizmek için sığır serum albümini veya aracı ile negatif bir kontrol kullanın ve tüm deneysel koşullar için kapı içindeki olayların yüzdesini ölçün.