JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 3:29 dk • July 8th, 2025
Kemik iliği türevi makrofajlar veya BMM'ler içeren lameller içeren iki mikroplaka alın.
Leishmania metasiklik promastigotları - uzun kamçılı aşama - bir plakaya ve amastigotları - oval kamçısız aşama - başka bir plakaya ekleyin.
Kuluçka sırasında, parazitler makrofaj reseptörlerine bağlanarak reseptör aracılı fagositozu tetikler.
Fagozom, endoplazmik retikulum ve Golgi aygıtından türetilen lizozomlar ve veziküllerle birleşerek parazitohorlu bir vakuole olgunlaşır.
Vakuolün azalmış pH'ı, promastigotun amastigota farklılaşmasını ve replikasyonunu tetikler.
İçselleştirilmemiş parazitleri gidermek için yıkayın.
Enfekte makrofajları düzeltin ve hücrelere ve parazitlere nüfuz etmek için deterjan ekleyin.
Makrofaj ve parazit çekirdeklerini lekelemek için bir floresan nükleik asit boyası ekleyin.
Lamelleri slaytlara monte edin ve daha büyük konak çekirdeklerini ve çevreleyen daha küçük amastigot çekirdeklerini ölçerek bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Başlangıçta farklılaşmamış promastigotlarla enfekte olmuş makrofajlar ve replikatif amastigotlarla enfekte olmuş makrofajlar içindeki çoğalmalarını değerlendirmek için amastigot sayılarını karşılaştırın.
Hücreleri L. Amazonensis ile enfekte etmek için, parazit süspansiyonunu uygun deneysel enfeksiyon çokluğuna seyreltin ve deneyin tüm zaman noktaları da dahil olmak üzere tüm 6 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 50 ila 100 mikrolitre parazit ekleyin. Kemik iliği kaynaklı makrofajları uygun enfeksiyon süresi ve sıcaklığı için inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları kuyucuk başına kalsiyum veya magnezyum içermeyen 2 mililitre taze 37 santigrat derece PBS ile üç kez yıkayın ve ilk zaman noktası örneklerini 10 dakika boyunca 1,5 ila 2 mililitre% 2 paraformaldehit ile sabitleyin.
Daha sonraki zaman noktalarına karşılık gelen plakalar için, her bir oyuğa 2 mililitre taze kemik iliği türevi makrofaj ortamı ekleyin ve plakaları uygun inkübatöre geri koyun. Ardından, az önce gösterildiği gibi kalan her zaman noktası için hücreleri sabitleyin ve yıkayın ve örnekleri 4 santigrat derecede taze PBS'de saklayın.
Hücreleri DAPI ile lekelemek için, süpernatanı kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1,5 mililitre taze PBS ile değiştirin, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0,1 iyonik olmayan deterjan ile takviye edin, ardından kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ile üç adet 2 mililitrelik yıkama yapın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1 mililitre PBS'de mililitre DAPI başına 2 mikrogram ile boyayın.
Üç yıkamadan sonra, lamelleri hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, piyasada bulunan bir solma önleyici montaj reaktifi ile monte edilmiş ayrı cam mikroskop slaytlarına yerleştirin. Daha sonra, enfekte olmuş hücrelerin sayısını ölçmek için, her büyük DAPI ile boyanmış makrofaj çekirdeğinin etrafında kümelenmiş daha küçük amastigot çekirdeklerinin sayısını belirlemek için bir floresan mikroskobu ve Emanuel sayacının 100x daldırma yağı objektifini kullanın.