Antimikrobiyal Proteinlerin Enzimatik Aktivitesini Ölçmek için Bir Boya Salınım Testi

Isıyla öldürülmüş bakteri süspansiyonu içeren bir tüp ile başlayın ve bir boya çözeltisi ile muamele edin.

Boya molekülleri, bakteri hücre duvarının önemli bir bileşeni olan peptidoglikana kovalent olarak bağlanır ve mavi bir renk verir.

Bakterileri peletleyin ve bağlanmamış boya molekülleri içeren süpernatanı çıkarın.

Bakterileri yeniden süspanse edin ve tüpe bir antimikrobiyal protein çözeltisi ekleyin, bakteriyel peptidoglikanın enzimatik hidrolizini tetikleyin, bu da hücre duvarı bozulmasına ve ardından hücre lizizine neden olur.

Bu, boya moleküllerinin salınmasına yol açarak mavi renklenme sağlar.

Antimikrobiyal proteinleri inaktive eden ve enzimatik reaksiyonu sonlandıran bir protein denatüre edici ajan olan etanol ekleyin.

Hücre parçalarını ve enzimleri peletlemek için içeriği santrifüjleyin. Boya molekülü içeren süpernatanı çok kuyulu bir plakaya aktarın.

Bir plaka okuyucu kullanarak, absorbansı 595 nanometrede ölçün.

Antimikrobiyal proteinin enzimatik aktivitesini ölçmek için enzimle muamele edilmiş numunenin absorbansını enzimle muamele edilmemiş numuneninkiyle karşılaştırın.

Boya salım testinde, substrat kovalent olarak Remazol Brilliant Blue R boyası veya RBB ile bağlanır. Bu protokole 200 milimolar bir RBB çözeltisi yaparak başlayın. 1.25 gram RBB'yi taze hazırlanmış bir sodyum hidroksit çözeltisi içinde çözün.

Daha sonra, ısıyla öldürülen bakteri hücrelerini, 30 mililitre RBB çözeltisi içinde 0.5 gram ıslak ağırlık konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Saflaştırılmış peptidoglikan için, peptidoglikanı 0.3 gram ıslak ağırlık ve 30 mililitre RBB çözeltisi konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

Sonraki adımlar, kullanılan substrattan bağımsız olarak aynı olduğundan, etiketleme yalnızca bakteri hücreleri için gösterilecektir. Reaksiyon karışımını, hafifçe karıştırarak 37 santigrat derecede altı saat boyunca dönen bir platformda inkübe edin. Altı saat sonra, reaksiyon karışımını 4 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın ve hafifçe karıştırarak 12 saat daha inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandığında, boyalı substratı 30 dakika boyunca 3.000 kez g'da santrifüjleme ile hasat edin. Boya çözeltisini substrat peletinden boşaltın. Peletleri tip 1 suda iyice tekrar süspanse edin ve ardından santrifüjleyin. Kovalent olarak bağlı olmayan çözünür boyayı substratlardan çıkarmak için boya etiketli hücreleri bu şekilde üç ila beş kez yıkayın.

Son yıkamalar için, boya salım tahlilinde kullanılacak olan pelet kısmını 1,5 mililitrelik mikrofüj tüplerine aktarın. Alt tabaka mavi kalırken, son yıkamanın süpernatanı berrak olmalıdır. Boyalı alt tabakayı, kullanıma hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede minimum miktarda suda asılı halde saklayın.

Boya salım testine hazırlanmak için, donmuş boyalı substratın oda sıcaklığına dönmesine izin verin ve enzim için ampirik olarak belirlenen test tamponu ile iki kez yıkayın. Bu durumda PBS kullanılır. 200 mikrolitrelik reaksiyon hacmini, gerçekleştirilecek boya salma testlerinin sayısı ile çarparak ihtiyaç duyulan substrat süspansiyonunun hacmini hesaplayın.

Alt tabaka süspansiyonunu hazırlamak için, önce boyalı alt tabakayı uygun PBS hacmine ekleyin. Bire bir seyreltme yapın ve PBS'yi boş olarak kullanarak 595 nanometrede optik yoğunluğun ilk ölçümünü yapın. 595 nanometrede 2.0'lık bir optik yoğunluk elde edilene kadar boyalı alt tabakanın artımlı miktarlarını süspansiyona ekleyin.

Bu demonstrasyonda, bir protein antimikrobiyal için en uygun inkübasyon koşullarını belirlemek için boya salım testi kullanılacaktır. İlk olarak, protokol metninde açıklandığı gibi PBS kullanarak konsantrasyonu mililitre başına 1 miligrama ayarlayarak bir stok protein antimikrobiyal süspansiyonu hazırlayın. Ardından, stok protein antimikrobiyal süspansiyonunu mikrolitre başına 100 nanogramlık bir konsantrasyona seyreltin.

Bu konsantrasyon, tahlil reaksiyonuna eklenen hacim başına 1 mikrogram proteinin nihai reaksiyon kütlesini verir. Değerlendirilecek termal aralık için reaksiyon testlerini 0,5 mililitrelik mikrofüj tüplerinde gerçekleştirin. Her termal koşul için, 200 mikrolitre hazırlanmış substrat süspansiyonuna 10 mikrolitre stok protein ekleyin.

Saatte bir kez ters çevirerek karıştırarak sekiz saat boyunca bir termal döngüleyicide inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir mikrofüj tüpüne 25 mikrolitre etanol ekleyerek reaksiyonları durdurun. Sindirilmemiş çözünmeyen substratı çıkarmak için, iki dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin. Bundan sonra, sindirilmemiş substratın peletini bozmamaya dikkat ederken, her reaksiyon karışımı için 150 mikrolitre reaksiyon süpernatantını 96 oyuklu düz tabanlı bir mikroplakaya aktarın.

Enzimatik aktiviteyi ölçmek için, süpernatantın absorpsiyonunu 595 nanometrede ölçmek için bir mikroplaka spektrofotometresi kullanın. Etiketli substrattan süpernatan salınan çözünür boya tarafından artan absorbans, enzimatik aktivitenin kantitatif bir ölçümüdür.