Antimikrobiyal Proteinlerin Enzimatik Aktivitesini Ölçmek için Bir Boya Salınım Testi
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 6:01 dk. • July 8th, 2025
Isıyla öldürülmüş bakteri süspansiyonu içeren bir tüp ile başlayın ve bir boya çözeltisi ile muamele edin.
Boya molekülleri, bakteri hücre duvarının önemli bir bileşeni olan peptidoglikana kovalent olarak bağlanır ve mavi bir renk verir.
Bakterileri peletleyin ve bağlanmamış boya molekülleri içeren süpernatanı çıkarın.
Bakterileri yeniden süspanse edin ve tüpe bir antimikrobiyal protein çözeltisi ekleyin, bakteriyel peptidoglikanın enzimatik hidrolizini tetikleyin, bu da hücre duvarı bozulmasına ve ardından hücre lizizine neden olur.
Bu, boya moleküllerinin salınmasına yol açarak mavi renklenme sağlar.
Antimikrobiyal proteinleri inaktive eden ve enzimatik reaksiyonu sonlandıran bir protein denatüre edici ajan olan etanol ekleyin.
Hücre parçalarını ve enzimleri peletlemek için içeriği santrifüjleyin. Boya molekülü içeren süpernatanı çok kuyulu bir plakaya aktarın.
Bir plaka okuyucu kullanarak, absorbansı 595 nanometrede ölçün.
Antimikrobiyal proteinin enzimatik aktivitesini ölçmek için enzimle muamele edilmiş numunenin absorbansını enzimle muamele edilmemiş numuneninkiyle karşılaştırın.
Boya salım testinde, substrat kovalent olarak Remazol Brilliant Blue R boyası veya RBB ile bağlan
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin