JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 5:10 dk • July 8th, 2025
Hem pyomelanin hem de pyomelanin üretmeyen bakteri suşlarını bir test ajanı ile tedavi edin.
Hücre dışı bir pigment olan pyomelanin, oksidatif strese karşı koruma sağlar.
Test ajanı, piyomelanin biyosentezini bozarak üretimini azaltır.
İnkübasyon sonrası, test ajanı veya araç çözücüsü içeren bir tampon ile seri bakteriyel seyreltmeler gerçekleştirin.
Oksidatif bir stres etkeni olan değişen hidrojen peroksit konsantrasyonlarına sahip agar plakaları üzerindeki bakteriyel seyreltmeleri tespit edin.
Hidrojen peroksit içermeyen plakalar kontrol görevi görür.
Kuluçkaya yatmak. Kontrol plakalarında bakteriler koloniler oluşturur.
Tedavi edilmemiş piyomelanin üreten suşta, pyomelanin bakterileri hidrojen peroksitin neden olduğu oksidatif hasardan koruyarak pigmentli kolonilere neden olur.
Bununla birlikte, test ajanı ile muamele edilen ve azalmış pyomelanin sergileyen piyomelanin üreten suş, oksidatif strese duyarlı hale gelir ve bakteri ölümüne neden olur.
Kolonileri sayın.
Tedavi edilmiş piyomelanin üreten ve hem tedavi edilmiş hem de tedavi edilmemiş piyomelanin üretmeyen suşlarda kontrollere göre artan hidrojen peroksit konsantrasyonları ile azalan koloni sayısı ve boyutu, oksidatif strese karşı artan bakteriyel duyarlılığı gösterir.
Bu prosedüre başlamak için, NTBC ile ve NTBC olmadan LB'de test edilecek suşların gece boyunca kültürlerini ayarlayın. Ertesi gün, oksidatif stres etkeni olarak hidrojen peroksit içeren LB agar plakalarını hazırlayın. İlk olarak, LB agar şişelerini eritin ve ortamı oda sıcaklığında yaklaşık 50 santigrat dereceye kadar soğutun.
Daha sonra, istenen konsantrasyonlarda doğrudan soğutulmuş ortama hidrojen peroksit ekleyin. Karıştırmak için şişeyi döndürün. 0 ila 1 milimolar arasında bir dizi hidrojen peroksit konsantrasyonu iyi bir başlangıç noktasıdır. Plakaları hemen dökün ve kabarcıkları çıkarmak için yüzeyi alevlendirin. Verim, 100 milimetre LB agar başına dört plakadır. Plakaları hidrojen peroksit konsantrasyonu ile işaretleyin.
Plakaları, plakalardaki fazla nemi gidermek için 30 dakika boyunca çalışan bir fan ile biyolojik bir akış başlığına üstü açık olarak yerleştirin. Plaklar hazırlandığı gün kullanılmalıdır. Plakalar kururken, gece boyunca kültürlerin OD600'ünü yıkayın ve ölçün.
Tüm gece kültürlerinin OD600'ünü, test edilen suş seti için en düşük değere normalleştirin. Bunu yapmak için, kültürü toplam 1 mililitre hacminde en düşük OD600'e seyreltmek için gereken kültür hacmini belirleyin.
Örneğin, bir kültürün OD600'ü 3 ise ve suş kümesi için en düşük OD600 2,5 ise, gereken kültür hacmi olarak 0,833 mililitre ile sonuçlanacak olan aşağıdaki hesaplamayı yapın. 0.833 mililitre kültürü bir mikrofüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra, kültür hacmini 1 mililitreye getirmek için gereken LB artı NTBC veya LB artı DMSO miktarını hesaplayın. Bu örnekte, miktar 0.167 mililitre olacaktır. Girdap yaparak karıştırın.
Kültürleri sabit bir NTBC veya DMSO konsantrasyonunda tutmak için, normalleştirilmiş gece kültürlerinin PBS artı NTBC veya PBS artı DMSO'da 10 kat seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Kaç suşun test edildiğine bağlı olarak PBS artı NTBC ve PBS artı DMSO'nun stok çözeltilerini ölçeklendirin veya küçültün.
Bir suş için bir seyreltme seti için, toplam 720 mikrolitre hacim elde etmek için 300 mikromolar NTBC veya eşdeğer bir hacim DMSO'yu PBS ile karıştırın. 10 ila eksi 1 ila 10 ila eksi 7 seri dilüsyon için etiketlenmiş uygun mikrofüj tüplerine 90 mikrolitre PBS artı NTBC veya PBS artı DMSO ekleyin. Eksi 1 seyreltme tüpüne uygun 10 ila 1 mikrolitre kültür ekleyin.
Girdaplama ile karıştırın ve 10 ila eksi 1 seyreltmenin 10 mikrolitresini eksi 2 seyreltme tüpüne 10 ila eksi 2 seyreltme tüpüne aktarın. Seyreltmeler arasında pipet uçlarını değiştirerek, tüm seyreltmeler tamamlanana kadar tekrarlayın.
10 ila eksi 3 ila 10 ila eksi 7 seyreltmenin 5 mikrolitresini LB artı hidrojen peroksit plakaları üzerinde her suş için iki kopya halinde tespit edin. Noktalar en çok seyreltik ila en az seyreltik olacak şekilde kaplanmışsa bir pipet ucu kullanın. Sıvı plakaya kuruyana kadar plakayı eğmeyin veya eğmeyin. Plakaları 37 santigrat derecede inkübe edin. Suşa bağlı olarak 24 ila 48 saat boyunca. İyi büyüklükte koloniler ortaya çıktıktan sonra, bir transilluminatörün üzerinde bir CCD kamera kullanarak plakaları fotoğraflayın.