Antibakteriyel Ajanların Talınması için Bir Peg Plaka Biyofilm Testi

Bakteriyel biyofilmlerle kaplanmış silindirik desteklere veya mandallara sahip bir kapaklı bir mikrotitre plakası alın.

Biyofilm kaplı peg kapağını, biyofilme bağlı ölçümlere odaklanarak, gevşek bir şekilde bağlanmış veya planktonik bakterileri ortadan kaldırmak için tamponlu mikrotitre plaka kuyularına yerleştirin.

Durulanmış biyofilm kaplı peg kapağını, artan test antibakteriyel ajan konsantrasyonlarına sahip bir meydan okuma plakasına aktarın. Çalkalamadan inkübe edin.

Ajanın konsantrasyonuna ve antibakteriyel potansiyeline bağlı olarak, bakteriyel metabolik aktiviteyi ve biyofilm bütünlüğünü bozar.

Kuluçka sonrası, planktonik bakterileri uzaklaştırmak için peg kapağını tampon içeren plaka kuyucuklarına yerleştirin.

Hücre geçirgen, zayıf floresan bir boya olan resazurin içeren bir biyofilm geri kazanım ortamı ile mikrotitre plaka kuyucuklarına aktarın. Kuluçkaya yatmak.

Metabolik olarak aktif bakterilerde, dehidrojenaz enzimleri mavi renkli resazurin'i pembe renkli, floresan resorufin'e indirger.

Resazurin'e dönüşümün olmaması biyofilm eradikasyonunu gösterirken, resorufin'e dönüşüm canlı hücrelerin varlığını gösterir.

Resazorin dönüşümü sağlamayan en düşük test antibakteriyel ajan konsantrasyonu, minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunu gösterir.

Taze bir 96 oyuklu plaka alın ve B'den H'ye kadar olan sıraların her bir oyuğuna oda sıcaklığına dengelenmiş 100 mikrolitre CRPMI ekleyin. İstenen nihai konsantrasyonun 2 katına kadar 1.0 mililitre CRPMI içinde dört test bileşiğini ayrı ayrı seyreltin. A1 ila A3 kuyularına 200 mikrolitre bileşik bir, A4 ila A6 kuyularına 200 mikrolitre bileşik iki, A7 ila A9 kuyularına 200 mikrolitre bileşik üç ve A10 ila A12 kuyularına 200 mikrolitre bileşik dört ekleyin.

Test bileşiklerini çok kanallı bir pipet kullanarak seri olarak seyreltin. 100 mikrolitreyi A sırasından B satırına aktararak başlayın ve karıştırın. Bu şekilde 100 mikrolitreyi kuyuya aktarmaya devam edin. Her aktarımdan sonra karıştırın ve F sırasında durun. Karıştırdıktan sonra, F sırasından 100 mikrolitreyi bir atık kabına boşaltın. G ve H sıralarına herhangi bir sıvı aktarmayın. Son olarak, son hacmi 200 mikrolitreye getirmek için çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre CRPMI ekleyin.

Biyofilm başlatma plakasınınkiyle aynı boyutlara sahip oyuklara sahip taze steril 96 oyuklu bir plakaya 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin ekleyin. Ardından, plastik torbayı ve parafin filmi inkübe edilmiş biyofilm başlatma plakasından çıkarın. Biyofilme zarar verebileceğinden mandallar ile plaka tabanı arasındaki temastan kaçınarak kapağı düz bir şekilde yukarı kaldırın. Sonraki OD₆₀₀ analizi için alt kısmı saklayın.

Peg kapağını PBS içeren plakaya yerleştirerek planktonik hücreleri durulayın. Mandalları 5 saniye daldırın, PBS'den kaldırın ve mandalları kuyu kenarlarına çarpmamaya dikkat ederek bir kez daha suya daldırın. Durulanmış mandal kapağını meydan okuma plakasına yerleştirin. Mandallar ve alt plaka arasında gereksiz temastan kaçının, çünkü bu biyofilme zarar vererek tutarsız sonuçlara yol açacaktır.

Plakayı parafin film ile kapatın ve daha önce olduğu gibi sızdırmaz bir plastik torbaya koyun. Plakayı% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 24 saat boyunca çalkalamadan inkübe edin. Biyofilm başlatma plakasının altını alın ve çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuktaki bakterileri yeniden süspanse edin. Tüm kuyucuklarda meydana gelen büyümeyi doğrulamak için OD_600'ü uygun bir mikroplaka okuyucu ile ölçün, ancak sterilite H satırındaki kontrolleri kontrol eder.

Bir inkübasyon odası ile donatılmış ve resazurin dönüşümünü tespit etmek için kinetik floresan okumaları alabilen bir plaka okuyucu kullanın. 530 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon kullanarak 24 saatlik kinetik floresan ölçümü ayarlayın. Oda sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın ve plakanın her 20 dakikada bir okunmasını sağlayın.

Plaka okuyucuyu, üreticinin talimatlarına göre plakanın altından ölçülecek şekilde ayarlayın. Çok kanallı bir pipet ile steril 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre PBS ekleyerek plakayı yıkamaya hazırlanın. Daha sonra, 20 mililitre CRPMI ortamına mililitre başına 0.8 miligram 400 mikrolitre resazurin stok çözeltisi ekleyerek, mililitre resazurin başına 16 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar biyofilm geri kazanım ortamı hazırlayın.

Daha sonra, 96 oyuklu yeni bir plakanın her bir oyuğuna çok kanallı bir pipetle 150 mikrolitre biyofilm geri kazanım ortamı ekleyin. Meydan okuma plakasını inkübatörden bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve plastik torbayı ve sızdırmazlık filmini dikkatlice çıkarın. Peg kapağını meydan okuma plakasından çıkarın ve planktonik hücreleri daha önce olduğu gibi PBS'de durulayın, sonraki OD₆₀₀ analizi için meydan okuma plakasının altını tutun.

Durulamadan sonra, peg kapağını biyofilm geri kazanım ortamını içeren plakanın tabanına yerleştirin. Plakanın yan tarafını parafin film ile sarın, çevre kuyucuklarının dibini tıkamamaya dikkat edin. Plakayı sardıktan hemen sonra, plaka okuyucuya yerleştirin ve daha önce yapılmış resazurin kinetik protokolünü başlatarak 24 saatlik bir süre boyunca kinetik bir okuma başlatın.