Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Buz üzerinde memeli hücreleri içeren bir mikroplaka alın.

Seçilen kuyucuklara kalsiyum içeren bir ortam ve diğerlerine kalsiyum içermeyen bir ortam ekleyin.

Bakteriyel gözenek oluşturan bir toksinin monomerlerini tanıtın. Düşük bir sıcaklık, monomer agregasyonunu önleyerek hücre zarı kolesterolüne bağlanmayı kolaylaştırır.

Fizyolojik bir sıcaklıkta inkübe edin, kolesterole bağlı monomerlerin oligomerleşmesine ve zara girmesine izin vererek bir gözenek oluşturun.

Hücre dışı kalsiyum içeren kuyularda, gözenek kalsiyum akışına neden olur.

Akın, toksinin ekzozomal dökülmesini ve zarın yeniden sızdırmazlığını tetikler.

Hücre içi kalsiyum artışı ayrıca lizozomal ekzositozu indükleyerek zarın sfingomyelinini seramide dönüştüren bir enzim salgılar.

Seramidle zenginleştirilmiş zar, toksin endositozunu tetikleyerek zarı yeniden kapatır.

Hücre dışı kalsiyum içermeyen kuyucuklarda zarın yeniden sızdırmazlığı engellenir.

Propidyum iyodür veya PI ekleyin - bir floresan boya - onarılmış bir zara sahip hücrelere giremez, ancak DNA'yı bağlamak için hasarlı hücrelere girer ve floresan yayar.

Membranın yeniden sızdırmazlık verimliliğini değerlendirmek için floresansı belirli aralıklarla ölçün.

Onarım izin verilen koşullar için yüksek verimli floresan bazlı bir tahlil oluşturmak için, hücreleri oyuk başına 200 mikrolitre 37 santigrat derece M1 ortamı ile iki kez yıkayın ve ikinci yıkamayı attıktan sonra 30 mikromolar propidyum iyodür ile desteklenmiş 100 mikrolitre taze 37 santigrat derece M1 ortamı ekleyin.

Kısıtlayıcı koşulları onarmak için, hücreleri bir kez oyuk başına 5 milimolar EGTA ile desteklenmiş 200 mikrolitre 37 santigrat derece M2 ortamı ile yıkayın, ardından tek başına 200 mikrolitre M2 ortamı ile bir yıkama yapın.

İkinci yıkamayı attıktan sonra, oyuk başına 30 mikromolar propidyum iyodür ile desteklenmiş 100 mikrolitre taze 37 santigrat derece M2 ortamı ekleyin. Ardından, plakayı az önce gösterildiği gibi iletilen ışık, GFP ve PI altında görüntüleyin. Plaka görüntülenirken, 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir polipropilen mikroplakayı buzun üzerine yerleştirin ve plakayı önceki plaka için gösterildiği gibi yapılandırın.

Onarım izin verilen koşullar için, oyuk başına 60 mikromolar propidyum iyodür ile desteklenmiş 100 mikrolitre buz gibi soğuk M1 ortamı ekleyin, ardından oyuk başına 4x listeriolizin O ile veya 4 olmadan 100 mikrolitre buz gibi soğuk M1 ekleyin.

Onarım kısıtlayıcı koşullar için, oyuk başına 60 mikromolar propidyum iyodür ile desteklenmiş 100 mikrolitre buz gibi soğuk M2 ortamı ekleyin, ardından oyuk başına 100x listeriolizin O ile veya 4 olmadan 2 mikrolitre buz gibi soğuk M2 ekleyin.

Kinetik testin başlamasından yaklaşık 5 dakika önce, plaka 1 buz üzerindeyken ve plaka 2 hazırlanırken, listeriolizin O'nun buz üzerinde uygun deneysel konsantrasyonda hazırlanması zorunludur.

İlk plakanın görüntülemesi bittiğinde, plakayı hemen buz üzerinde bir alüminyum folyo tabakasına aktarın. 5 dakika sonra, ikinci plakanın her bir oyuğundan 100 mikrolitreyi ilk soğutulmuş plakadaki uygun karşılık gelen kuyucuğa aktarın, pipet uçlarını her bir oyuktaki çözelti menisküsünün altına sokarak toksinin uygun şekilde dağılması için hacmi karıştırmadan çıkarın.

Toksinin konakçı hücrelere 1 dakika boyunca bağlanmasına izin verin ve spektroflorometre modunu kullanarak postkinetik test için ilk plakayı hemen plaka okuyucuya aktarın. Kinetik tahlilin sonunda, prekinetik görüntüleme için gösterildiği gibi plaka görüntüsünün hemen postkinetik bir görüntüsünü elde edin.