Kuduz Virüsü Antijenlerinin Saptanmasına Yönelik Bir İmmünohistokimya Boyaması

Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü kuduz virüsü ile enfekte olmuş fare beyin dokusu bölümünü taşıyan bir slaytla başlayın. Sabit bölüm, protein çapraz bağlanması yoluyla viral antijenleri tutar.

Parafini çıkarmak için slayta bir ksilen çözeltisi uygulayın.

Dokuyu yeniden sulandırmak ve sulu çözeltilerle uyumlu hale getirmek için slaytı azalan etanol konsantrasyonlarına daldırın.

Protein çapraz bağlarını bozmak ve antijen erişilebilirliğini artırmak için proteaz içeren bir tampon ekleyin.

Endojen peroksidazları bloke etmek için hidrojen peroksite batırın ve spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için bir bloke edici solüsyon uygulayın.

Antijen-antikor kompleksleri oluşturan kuduz antijenine özgü primer antikorları tanıtın.

Birincil antikorlara bağlanan biyotinile ikincil antikorlar ekleyin. Biotin ile etkileşime giren streptavidin konjuge peroksidaz enzimleri ile inkübe edin.

Eflatun kırmızı bir çökelti üreten bir peroksidaz substratı ekleyin.

Dokuyu nükleer bir leke ile boyayın, ardından bir mavileştirme maddesi uygulayın ve çekirdekleri maviye boyayın.

İmmünohistokimya görüntüsü, sitoplazmada macenta-kırmızı lekeleri ortaya çıkararak doku bölümünde kuduz antijenlerinin varlığını doğrular.

Bir mikrotom kullanarak 5 mikrometrelik bir parafin bölümü yapın. Bölümü 38 santigrat derecede bir su banyosunda yüzdürün ve cam slaytların üzerine toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalemle etiketleyin. Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve 55 ila 60 derecelik bir fırında bir saat eritin.

Ardından, slaytları fırından çıkarın ve her biri beş dakikalık üç ardışık ksilen durulama kullanarak hemen deparafinize edin. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, etanolün deiyonize suya indirgenen seyreltmelerine sıralı daldırmalarla slayt üzerindeki bölümleri yeniden sulandırın.

Proteolitik antijen alımı için slaytları proteaz ile 30 dakika tedavi edin, ardından slaytları PBST'de 10 dakika durulayın ve 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile muamele edin. Bundan sonra, slaytları tekrar PBST ile 10 dakika yıkayın.

Başlamak için, bir slaytı tampondan çıkarın, diğerleri su altında kalırken bir seferde yalnızca bir slaytı tuttuğunuzdan emin olun ve doku bölümünün etrafındaki fazla tamponu temizlemek için bir kağıt havlu kullanın. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve normal keçi serumu ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, nem odasındaki slaytları, önceden belirlenmiş optimal seyreltme birincil anti-kuduz antikoru ve negatif kontrol antikorları ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca aralarında yıkama yapmadan inkübe edin. Bundan sonra, slaytları PBST ile 10 dakika yıkayın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında biyotinile antikor ile bir nem odasında inkübe edin.

Slaytları tekrar PBST ile 10 dakika yıkayın. Slaytları streptavidin-HRP kompleksi içeren bir nem odasında oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve PBST'yi 10 dakika yıkayın. Ardından, AEC ile oda sıcaklığında bir nem odasında 10 dakika inkübe edin. Slaytları deiyonize suda 10 dakika yıkayın ve iki dakika boyunca deiyonize su ile 1 ila 2 oranında seyreltilmiş Gill'in hematoksilen ile lekeleyin.

Bundan sonra, slaytları deiyonize suya daldırarak durulayarak fazla hematoksilini durulayın. Slaytları Scott'ın musluk suyunda 30 saniye durulayın ve deiyonize suda 10 dakika yıkayın. Kızakları teker teker çıkarın ve suda çözünür montaj ortamı ile monte edin. Ardından, slaytları okumak için bir ışık mikroskobu kullanın.