Fare Testislerinde Proteine Bağlı RNA'nın Verimli Tanımlanması için Gelişmiş Bir Çapraz Bağlama İmmünopresipitasyon Yöntemi

Soğutulmuş bir tamponda taze hasat edilmiş bir fare testisi alın. Fibröz doku tabakası olan tunika albuginea'yı çıkarın.

Germ ve Sertoli hücreleri içeren seminifer tübülleri serbest bırakmak için testisi tritüre edin.

Tampon ekleyin ve etkileşimleri koruyarak RNA'nın ilişkili proteinlerle geri dönüşümsüz çapraz bağlanması için tübülleri UV radyasyonuna maruz bırakın.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Tübülleri RNaz ve proteaz inhibitörleri içeren bir lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Dokuyu sonikasyon, protein-RNA kompleksleri ve diğer hücre içi bileşenleri serbest bırakır. RNaz ve proteaz inhibitörleri, endojen RNazları ve proteazları inaktive eder.

DNA'yı parçalamak için DNaz ekleyin. Kısmi RNA sindirimi için seyreltilmiş RNaz'ı tanıtın.

Süpernatan içeren RNA-protein komplekslerini santrifüjleyin ve hedef RNA bağlayıcı proteine yüksek özgüllüğe sahip antikor kaplı bir manyetik boncuk çözeltisine aktarın.

Boncuk bağlı protein-RNA komplekslerini ayırmak için bir manyetik alan uygulayın. Süpernatanı atın.

Tampon ile yıkayınız. Protein-RNA komplekslerini manyetik olarak ayırın ve bunları daha fazla RNA-protein etkileşim analizi için kullanın.

Bu işleme başlamak için, her immünopresipitasyon deneyi için uygun yaştaki farelerden yaklaşık 100 miligram testis toplayın. Dokuları buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin. Bir çift ince uçlu cımbız kullanarak tunika albuginea'yı nazikçe çıkarın. Bir doku öğütücüye 3 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve dokuyu hafif mekanik kuvvetle ezmek için gevşek bir cam havaneli kullanın. Daha sonra, doku süspansiyonunu bir hücre kültürü kabına aktarın ve 6 mililitreye kadar buz gibi soğuk PBS ekleyin. Plakayı hızlı bir şekilde çalkalayın, böylece sıvı tabağın altını eşit şekilde kaplar.

Süspansiyonu buz üzerinde 400 nanometrede santimetre kare başına 254 milijoule ile üç kez çapraz bağlayın. Süspansiyonu her ışınlama arasında karıştırdığınızdan emin olun, ardından süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve 1.200 kez g ve 4 derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bundan sonra, süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. 1.000 kez g ve 4 santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

İlk olarak, taze bir santrifüj tüpüne numune başına 125 mikrolitre protein A manyetik boncuk ekleyin. Boncukları çözeltiden ayırmak için tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin. 10 saniye sonra, süpernatanı çıkarın ve boncukları 1 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Boncukları 10 mikrogram eCLIP antikoru ile 100 mikrolitre soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpleri oda sıcaklığında 45 dakika döndürün, ardından boncukları 1 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile iki kez yıkayın.

Başlamak için, doku peletlerini 22 mikrolitre 50X EDTA içermeyen protein inhibitörü kokteyli ve 11 mikrolitre RNAse inhibitörü içeren 1 mililitre soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneleri 15 dakika buz üzerinde parçalamaya devam edin. Her numuneyi sonikleştirin, metin protokolünde özetlenmiştir. Daha sonra, her tüpe 4 mikrolitre DNAse ekleyin ve iyice karıştırın. 1.200 RPM'de çalkalarken 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, 10 mikrolitre seyreltilmiş RNAse ekleyin ve iyice karıştırın. 1.200 RPM'de çalkalarken 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin.

Daha sonra, lizatı temizlemek için 15.000 kez g ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice toplayın. İlk olarak, hazırlanan boncuklara 1 mililitre lizat ekleyin ve numuneleri iki saat veya gece boyunca 4 santigrat derecede döndürün. Bundan sonra, boncukları manyetik stand ile toplayın ve süpernatanı atın. Boncukları 900 mikrolitre yüksek tuz tamponu ile iki kez yıkayın ve ardından boncukları 900 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.