Fare Testislerinde Proteine Bağlı RNA'nın Verimli Tanımlanması için Gelişmiş Bir Çapraz Bağlama İmmünopresipitasyon Yöntemi

Soğutulmuş bir tamponda taze hasat edilmiş bir fare testisi alın. Fibröz doku tabakası olan tunika albuginea'yı çıkarın.

Germ ve Sertoli hücreleri içeren seminifer tübülleri serbest bırakmak için testisi tritüre edin.

Tampon ekleyin ve etkileşimleri koruyarak RNA'nın ilişkili proteinlerle geri dönüşümsüz çapraz bağlanması için tübülleri UV radyasyonuna maruz bırakın.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Tübülleri RNaz ve proteaz inhibitörleri içeren bir lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Dokuyu sonikasyon, protein-RNA kompleksleri ve diğer hücre içi bileşenleri serbest bırakır. RNaz ve proteaz inhibitörleri, endojen RNazları ve proteazları inaktive eder.

DNA'yı parçalamak için DNaz ekleyin. Kısmi RNA sindirimi için seyreltilmiş RNaz'ı tanıtın.

Süpernatan içeren RNA-protein komplekslerini santrifüjleyin ve hedef RNA bağlayıcı proteine yüksek özgüllüğe sahip antikor kaplı bir manyetik boncuk çözeltisine aktarın.

Boncuk bağlı protein-RNA komplekslerini ayırmak için bir manyetik alan uygulayın. Süpernatanı atın.

Tampon ile yıkayınız. Protein-RNA komplekslerini manyetik olarak ayırın ve bunları daha fazla RNA-protein etkileşim analizi için kullanın.

Bu işleme başlamak için, her immü