JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 6:20 dk. • July 8th, 2025
Farklı hücre döngüsü aşamalarında antijene özgü CD8 + T hücreleri içeren, antijenle aşılanmış bir fareden ikincil lenfoid organ hücrelerini alın.
G1, S, G2 ve M aktif olarak bölünen hücrelerin aşamalarıdır, G0 aşamasındaki hücreler ise hareketsizdir.
Ölü hücreleri etiketlemek için bir floresan canlılık boyası ve T hücresi yüzey belirteçleri CD3 ve CD8'e bağlanan florofor etiketli antikorlar ekleyin.
Antijene özgü T hücrelerini etiketleyerek T hücresi reseptörlerini bağlamak için florofor konjuge antijenik peptit-MHC multimerlerini tanıtın.
Bir tampon kullanarak hücreleri sabitleyin ve geçirgen hale getirin.
Hücre proliferasyonu ile ilişkili bir nükleer proteini bağlamak için florofor etiketli antikorları tanıtın - aktif olarak bölünen hücreleri boyayın.
DNA'yı etiketlemek için bir floresan lekesi ekleyin.
Akış sitometrisini kullanarak, canlı hücreleri seçin ve yüzeye bağlı etiketler aracılığıyla antijene özgü CD8 + T hücrelerini tanımlayın.
DNA leke yoğunluğu, daha düşük DNA miktarına sahip G0 ve G1 hücrelerini, daha yüksek DNA miktarına sahip S, G2 ve M hücrelerinden ayırır. Nükleer proteine özgü antikorun yokluğu G0 hücrelerini ayırır.
10X geçirgenlik tamponunu damıtılmış su ile seyrelterek taze 1X geçirgenleştirme yıkama tamponu hazırlayın ve agregaları ortadan kaldırmak için 0,45 mikrometrelik bir filtreden süzün. Monoklonal antikor Ki67-FITC'yi, numune başına 100 mikrolitrelik bir nihai hacim için bir titrasyon deneyi ile belirlendiği gibi 1X geçirgenleştirme yıkama tamponunda seyreltin.
Hücreli her tüpe 3 mililitre 1X geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Yine, hücreleri peletlemek için 1X geçirgenleştirme yıkama tamponunu ve santrifüjü ekleyin, ardından süpernatanı atın.
Pelete 100 mikrolitre seyreltilmiş monoklonal antikor Ki67-FITC ekleyin, ardından girdap yapın ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri 4 mililitre 1X geçirgenlik tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Doğrudan akış sitometresinde alınacak numuneler için hücre peletine 350 mikrolitre PBS ve DNA boyama için Hoechst ile inkübe edilecek numuneler için hücre peletine 250 mikrolitre PBS ekleyin. Hoechst ve PBS çözeltisini hazırlayın ve her bir numuneye ekleyin, böylece nihai konsantrasyon mililitre başına 2 mikrogram olur. Örnekleri girdaplayın ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri 5 dakika santrifüjleyin ve hücre peletine 350 mikrolitre PBS ekleyin.
Yazılımı açın ve çalışma alanı şeridi bölümünde Grup Oluştur'a tıklayarak analiz edilecek farklı organlara karşılık gelen farklı gruplar oluşturun. Grup adına çift tıklayarak Grubu Değiştir penceresini açın ve Senkronize edildi işlevine bir onay işareti ekleyerek yeni oluşturulan grupları senkronize edin.
Her FCS dosyasını karşılık gelen grubuna sürükleyin, ardından bir LN grubundan başlayarak bir geçit stratejisi oluşturun. Bu örnek için elde edilen işlenmemiş olayları bir nokta grafiğinde görüntülemek için tamamen lekeli örneğe çift tıklayarak grafik penceresini açın. X ve y ekseninin, bu el yazmasının akış sitometresi ayarları dosyasının Tablo 2'sinde belirtildiği gibi FCS dosyalarında olduğu gibi etiketlendiğine dikkat edin. Uygun görselleştirme için yeterli sayıda olayın görüntülenip görüntülenmediğini kontrol edin.
Gerekirse, çalışma alanı şeridindeki kalp simgesine tıklayarak Tercihler'i açın, Grafikler'i ve ardından Grafik Türü olarak Nokta Çizimi'ni seçin ve ilgili kutuya çizilen nokta sayısının doğru olup olmadığını kontrol edin veya değiştirin. Grafik penceresindeki açılmamış olayları, x ekseninde DNA-A ve y ekseninde DNA-W ile bir nokta çiziminde görüntüleyin. Her iki eksen için de doğrusal ölçek kullanın. Gerekirse, grafik penceresinde her eksene yakın bir T ile gösterilen kutuya tıklayarak ölçeği logaritmikten doğrusala değiştirin.
Geçit Araçları bölümünde Dikdörtgen'e tıklayarak tek bir hücre popülasyonu seçin, ardından x ekseninde FSC-A parametresi ve y ekseninde ölü hücre boyası ile bir nokta çiziminde tek hücreleri görüntülemek için dikdörtgen kapının ortasına çift tıklayın.
Ölü hücre boyası için negatif olan canlı hücre popülasyonunu seçmek için Çokgen'e tıklayın. Hücreleri, x ekseninde FSC-A parametresi ve y ekseninde SSC-A parametresi ile bir nokta çiziminde görüntülemek için çokgen geçidin ortasına çift tıklayın.
Dikdörtgen'e tıklayın ve bu grafiğe tüm tek canlı hücreleri dahil etmek için "rahat" bir kapı oluşturun. Hücreleri x ekseninde CD3 ve y ekseninde CD8 olacak şekilde bir nokta çiziminde görüntülemek için gevşek kapının ortasına çift tıklayın.
Grafik penceresinde görselleştirme için uygun eksen ölçeğini kullanın. Gerekirse, her eksene yakın bir T ile gösterilen kutuya tıklayarak x ve y ölçeğini değiştirin. Eksen İşlevini Özelleştir'i seçin ve Ekstra Olumsuz On Yılları, Genişlik Temeli'ni ve Pozitif On Yıllar'ı gerektiği gibi değiştirin.
Polygon'a tıklayarak CD3 pozitif, CD8 pozitif hücreleri seçin. Hücreleri x ekseninde Tetr-gag ve y ekseninde Pent-gag ile bir nokta grafiğinde görüntülemek için CD3 pozitif, CD8 pozitif kapısının ortasına çift tıklayın. Poligon'a tıklayarak antijene özgü CD8 T hücrelerini seçin. Hücreleri, x ekseninde DNA-A ve y ekseninde Ki67 ile bir nokta grafiğinde görüntülemek için gag'a özgü kapının ortasına çift tıklayın. Grafik penceresinin Geçit Araçları bölümünde Dörtlü'ye tıklayarak farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri seçin.