Mikroglial alım kantifikasyonu için sıfır hipotezi testi neden önemlidir?

Sıfır hipotezi testi, mikroglial fagositozda gözlemlenen farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olmasını sağlayarak güçlü hedef doğrulamasını destekler ve erken keşif aşamasındaki yanlış pozitifleri azaltır.

Bağımsız değişken izolasyonu, akış sitometrisi iş akışına nasıl uyum sağlar?

Spesifik antikor işaretlemesi ve kapılama (gating) yoluyla hücre tipi ve canlılık gibi değişkenlerin izole edilmesi, fagositik aktivitenin mikroglia ile kesin olarak ilişkilendirilmesini sağlayarak mekanistik içgörüleri güçlendirir.

Bu analizde kantitatif bağımlı değişken ölçümleri neyi mümkün kılar?

Kantitatif floresan ölçümleri, farklı koşullar arasında mikroglial alımın doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanıyarak tarama ve hedef önceliklendirmede veri odaklı kararları kolaylaştırır.

Replikasyon gereksinimleri, fonksiyonlar arası iş birliği için neden kritiktir?

Akış sitometrisi sonuçlarının farklı deneyler ve ekipler arasında tekrarlanması, yeniden üretilebilirliği sağlar; böylece güvenilir veri paylaşımına ve daha geniş Ar-Ge iş akışlarına entegrasyona olanak tanır.

Akış sitometrisi okumaları uygulanmadan önce hangi istatistiksel analiz yetkinlikleri gereklidir?

Biyofarma süreçlerindeki sonraki karar alma aşamaları için çok parametreli akış sitometrisi verilerini analiz etmek, anlamlılığı değerlendirmek ve bulguları doğrulamak amacıyla güçlü istatistiksel araçlara ihtiyaç duyulmaktadır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 4:34 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, monositler ve nötrofiller dahil olmak üzere fare retinal miyeloid hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.

Mikroglia - veya retinal fagositik bağışıklık hücreleri, intravitreal olarak önceden enjekte edilen, yutulmuş florofor etiketli mantar kökenli biyopartiküller nedeniyle floresan sergiler.

Santrifüjleyin ve Fc reseptör antikorları ekleyin, spesifik olmayan etkileşim bölgelerini bloke edin.

CD11b, Ly6C ve Ly6G yüzey proteinlerini hedefleyen, onları eksprese eden miyeloid hücrelerle etkileşime giren florofor etiketli antikorlardan oluşan bir kokteyl tanıtın.

Bağlanmamış antikorları çıkarın. Hasarlı zarlardan nüfuz eden ve sadece ölü hücreleri boyayan propidyum iyodür ile tedavi edin.

Akış sitometrisinde, ölü hücreleri dışlamak ve floresan olmayan canlı hücreleri tanımlamak için propidyum iyodürü uyarın.

Hücreleri mor bir lazerle aydınlatın; uyarılmış canlı hücreler, CD11b eksprese eden miyeloid hücreleri belirtir.

Daha sonra, CD11b pozitif hücreler içindeki uzak kırmızıya yakın floroforu uyararak kırmızı bir lazerle aydınlatın, bu da Ly6C eksprese eden monositleri ve Ly6G eksprese eden nötrofilleri gösterir.

Hücreleri mavi bir lazerle uyarın; Kalan CD11b pozitif hücrelerden yeşil floresan emisyonu, floresan parçacıklarının mikroglial alımını doğrular.

İntravitreal enjeksiyondan üç saat sonra, göz küresini proptos etmek için göz kapağına hafifçe bastırmak için 45 derecelik açılı forseps kullanın. Forsepsleri göz küresinin arkasına yerleştirin ve çekin. Daha sonra, göz küresini diseksiyon mikroskobu altında kalsiyum ve magnezyum içeren küçük bir hacim PBS içeren bir Petri kabının kuru alanına aktarın ve kornea limpusunda gözü delmek için süper ince forsepslerin bir ucunu kullanın. Daha sonra, göz küresini 45 derecelik açılı forsepslerle tutarak, çevrenin kabaca yarısı kesilene kadar kornea limbusunun etrafını kesmek için yaylı makas kullanın.

Göz küresini PBS'ye aktarın ve kornea ve sklerayı ayırmak için ikinci bir çift ince 45 derece açılı forseps kullanın. Lens ve retina sağlam çıkacaktır. Lens ve retinanın ayrıldığından emin olun ve retinayı kalsiyum ve magnezyum içeren 2 mililitre PBS içeren 5,4 mililitrelik polistiren test tüpüne aktarın.

Retina hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir nöronal doku ayrışma kiti kullanın ve hücreleri 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, numuneyi 96 oyuklu U tabanlı bir plakanın bir kuyusuna aktarın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atmak için plakayı ters çevirin ve FC reseptörlerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca oyuk başına CD16 / CD32 antikoru içeren 25 mikrolitre leke tamponu ile bloke edin. Daha sonra, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ilgilenilen antikorlarla etiketleyin.

Daha sonra, hücreleri peletleyin ve bunu kuyucuk başına 200 mikrolitre taze boyama tamponunda yıkayarak takip edin. Şimdi, peletleri 200 mikrolitre leke tamponu ve canlılık boyası içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri 1.2 mililitrelik mikrotitre tüplerine aktarın. Daha sonra, kuyucukları ek 100 mikrolitre boyama tamponu ve canlılık boyası ile yıkayın ve yıkamaları akış sitometrisi ile analiz için ilgili numunelerle bir araya getirin.