İmmün Hücrelerin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu için Bir Barkodlama Testi

Uyarılmış ve sabitlenmiş bağışıklık hücreleri içeren test numuneleri ile başlayın.

Stimülasyon, hücrelerde spesifik belirteçlerin ekspresyonunu indüklerken, fiksasyon, hücre yüzeyi antijenleri dahil fenotipik belirteçleri ve sitokinler dahil olmak üzere fonksiyonel durum belirteçlerini korur.

Her numuneye ağır metal izotop konjuge antikorların benzersiz bir kombinasyonunu ekleyin.

Bu teknik, birden fazla numuneyi benzersiz bir şekilde barkodlar ve her numuneyi ağır metal izotoplarının kombinasyonu ile ayırt eder.

Antikorlar, numunelerdeki tüm hücreleri barkodlayarak ortak bir epitopa bağlanır.

Sonraki işlemler için tüm barkodlu numuneleri tek bir tüpte birleştirin.

Yüzey antijenlerini lekelemek için metal konjuge bir antikor kokteyli ekleyin.

Hücre içi boyama için hücre zarı geçirgenliğini artırmak için geçirgenleştirme tamponu ekleyin.

Hücre içi sitokinleri boyamak için başka bir metal konjuge antikor seti ekleyin.

Barkodlama, kütle sitometrisi yoluyla havuzlanan numunelerin aynı anda boyanmasını ve alınmasını sağlar. Bu teknik, fenotipik ve fonksiyonel durum belirteçlerinin değerlendirilmesini iyileştirerek test verimliliğini en üst düzeye çıkarır.

Parçalanmış sabit hücreleri barkodlamak için, numuneleri eksi 80 santigrat derece depodan yavaşça buz üzerinde çözdürün. 10x barkodlama perma tamponunu PBS ile 1 ila 10 oranında seyreltin ve numune başına 3 mililitre için yeterli tampon yapın.

Steril olmayan bir tekneyi CSM ve diğerini 1x barkodlama perma tamponu ile doldurun. Ardından, taze çözülmüş numunelere 1 mililitre buz gibi soğuk CSM ekleyin. İyice karıştırın ve ilgili önceden etiketlenmiş polipropilen küme tüplerine aktarın.

Şimdi, 10 mikrolitrelik bir örnek alın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Fazla hücre hacmini çıkararak her küme tüpündeki hücre sayımlarını normalleştirin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleyin. Hücreleri çok kanallı bir pipetle 1 mililitre 1x barkodlama perma tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin.

Küme tüplerini bir rafta, barkod anahtarında belirtildiği sırayla hizalayın, böylece numune barkoduyla eşleşir. Hücre kaybını azaltmak için hücre peletine dokunmadan küme tüplerindeki tüm numunelere çok kanallı pipet ile 800 mikrolitre 1x barkodlama perma tamponu ekleyin.

Ardından, küme tüplerinin bulunduğu rafı bir kenara koyun. 20-plex Paladyum barkodlama kiti tüp şeritlerini eksi 20 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. 100 mikrolitre 1x barkodlama perma tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve 120 mikrolitre yeniden askıya alınmış barkod karışımını küme tüplerindeki ilgili hücre örneklerine aktarın.

Çok kanallı pipetle iyice karıştırın, böylece ayrı ayrı barkodlanmış numuneler arasında çapraz kontaminasyon olmaz. Barkodların hücreleri etiketlemesine izin vermek için küme tüplerini oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. Ardından, bunları 1 mililitre CSM'de yeniden askıya alın. Daha sonra, CSM'de tekrar santrifüjleyin ve yeniden askıya alın.

Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Tek bir pipetle ve aynı ucu kullanarak, tüm hücre peletlerini ve yaklaşık 70 ila 80 mikrolitre artık hacmi bir polistiren tüpe aktarın. Pipet ucunu çıkarmayın. Bu uçla tek pipeti bir kenara koyun.

Çok kanallı bir pipet ve yeni uçlarla, hücre geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için her bir orijinal küme tüpüne 100 mikrolitre CSM ekleyin. Ucu bir kenara bırakılmış olan tek pipeti kullanarak, 100 mikrolitre artık hacimdeki tüm hücre peletlerini aynı polistiren tüpe aktarın. Polistiren tüpü yaklaşık 3 mililitreye kadar tamamlamak için CSM ekleyin. Havuza alınan barkod setinin hücre numarasını sayın ve kaydedin. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Barkodlu numuneleri aynı gün boyamaya devam edin.