Bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini değerlendirmek için DNA tabanlı gerilim problarının kullanılması

Polietilen glikol bağlantılı altın nanopartiküller içeren işlevselleştirilmiş bir cam lamel ile başlayın.

Zıt kollarda iki oligonükleotid ile hibritlenmiş bir DNA saç tokası içeren DNA saç tokası gerginlik probları ekleyin.

Ligand ipliği bir florofor ve biyotin içerirken, çapa ipliği bir söndürücü ve bir tiyol grubu içerir. Bu kurulumda, söndürücü floresansı bastırır.

DNA probları, cam lamele sabitlenerek altın nanopartiküllere bağlanır.

Ligand ipliklerinin biyotin molekülleri ile etkileşime giren streptavidin'i tanıtın.

Önceden bağlanmış streptavidin moleküllerine bağlanan biyotinile ligandlar ekleyin.

Lameli CD8 pozitif T hücreleri ile kaplayın; reseptörleri hareketsizleştirilmiş ligandlarla etkileşime girerek bir reseptör-ligand etkileşim bölgesi oluşturur.

Bu etkileşim, DNA saç tokası yapısını açan, floroforu söndürücüden ayıran ve floresan emisyonunu teşvik eden bir kuvvet oluşturur.

Floresan sinyalini korumak için probların katlanmamış segmentleriyle etkileşime giren floresan olmayan kilitleme şeritlerini tanıtın.

Bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini değerlendirmek için floresanı ölçün.

Başlamak için, 25 milimetrelik lamelleri 50 mililitrelik bir beherdeki politetrafloroetilen rafına yerleştirin ve lamelleri suya batırarak üç kez durulayın. Eşit hacimlerde etanol ve suyu karıştırın ve bu çözeltiden 40 mililitre rafı ve lamelleri içeren behere ekleyin. Ardından, parafilm bant kullanarak kabı kapatın.

Beheri ultrasonik bir temizleyicide 15 dakika boyunca sonikleştirerek lamelleri temizleyin ve sonikasyondan sonra sıvıyı atın. Ardından, kalan organik çözücüyü çıkarmak için rafı ve lamelleri içeren beheri en az altı kez suyla durulayın. Taze bir piranha çözeltisi hazırlamak için, 50 mililitrelik bir behere 30 mililitre sülfürik asit ekleyin ve yavaşça 10 mililitre hidrojen peroksit ekleyin. Bir cam pipetin ucunu kullanarak piranha çözeltisini yavaşça karıştırın.

Aşındırmayı başlatmak için, lamelleri tutan rafı piranha çözeltisi içeren behere aktarın ve lamelleri temizlemek ve hidroksilatlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, rafı çelik veya politetrafloroetilen cımbız kullanarak 50 mililitrelik temiz bir behere aktarın ve altı kez suyla durulayın. Suyu tamamen çıkarmak için, lamelleri tutan rafı 40 mililitre etanol içeren 50 mililitrelik bir behere daldırın, ardından etanolü atın.

Daha sonra, lameller üzerindeki hidroksil grubu ile reaksiyonu başlatmak için rafı oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 3 aminopropil trietoksi silan içeren 40 mililitre etanole daldırın. Lamelin yüzeyini 40 mililitre etanole batırarak altı kez durulayın ve 20 dakika boyunca 80 santigrat derecede bir fırında kurutun.

Lamellerin Petri kabının içinde kaymasını önlemek için Petri kabının iç altını parafilm bantla kapatın. Ardından, amin kaplı lameller, DNA gerilim probları yukarı bakacak şekilde işlevselleştirilecek tarafı gelecek şekilde yerleştirin. Lamelleri ileride kullanmak üzere eksi 20 santigrat derecede örtün.

Lamellerdeki amin gruplarını değiştirmek için lipoik asit-PEG-NHS ve mPEG-NHS ekleyin ve Petri kabını oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, yüzeyi üç kez suyla durulayın. Bundan sonra, bir dizi sandviç lamesine mililitre başına 1 miligram Sülfo-NHS-asetat içeren 100 mikrolitre 0.1 molar sodyum bikarbonat ekleyin ve pasivasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika inkübe edin.

Her lamel için 0,5 mililitre altın nanopartikül ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, lamelleri üç kez suyla durulayın. Tavlanmış DNA gerginlik probuna 10'a 1 oranında kara delik söndürücü 2 iplikçik ekledikten sonra, sandviçi yapmak için iki lamel başına 100 mikrolitre karışım ekleyin.

Islak bir laboratuvar doku topunu petri kabına lamellerden uzağa dikkatlice yerleştirin ve çözeltinin kurumasını önlemek için kabı parafilm bantla kapatın. Bundan sonra, tabağı bir folyo ile örtün ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, hazneyi sıkarken yüzey çatlamasını önlemeye dikkat ederek görüntüleme haznesini monte edin. Ardından, görüntüleme odasına 0,5 ila 1 mililitre Hank'in dengeli tuz solüsyonu ekleyin.

Yayılmaya başladıklarında DNA firkete gerginlik problarına kaplanmış hücrelerin floresan sinyallerini yakalamak için 100x objektifli Cy3B kanalını kullanın. 100 adet mikromolar floresan olmayan kilitleme iplikçik stoğu hazırlandıktan sonra, istenen zaman noktasında, gerginlik sinyalini depolamak için görüntüleme odasında 1 mikromolar final konsantrasyonunda hücrelere ekleyin ve pipetleme ile hücrelerle karıştırın.

Yaklaşık 10 dakikalık kilitlemeden sonra, hem kalitatif gerilim haritalaması hem de kantitatif analiz için epifloresan olarak hızlandırılmış filmler veya uç nokta görüntüleri elde edin.