Primer İnsan Bağışıklık Hücrelerinin Antifungal Aktivitesinin Gerçek Zamanlı Değerlendirmesi

İnsan nötrofillerinin veya bağışıklık hücrelerinin bir süspansiyonunu içeren cam bazlı bir görüntüleme kabı ile başlayın ve bunu bir floresan görüntüleme sistemi altında görselleştirin.

Genetiği değiştirilmiş floresan Aspergillus reporter conidia veya mantar sporlarını tanıtın ve 6 saate kadar düzenli aralıklarla görüntüler yakalayın.

Mantar sporları kırmızı floresan proteinleri eksprese eder ve harici olarak bozunmayan macenta floroforlarla etiketlenir - ölü hücreleri canlı hücrelerden ayırt etmeye yardımcı olur.

İnkübasyon sırasında, nötrofiller, örüntü tanıma reseptörleri aracılığıyla conidia üzerindeki patojenle ilişkili moleküllerle etkileşime girer ve bir fagozom içinde yutulmalarını kolaylaştırır.

Daha sonra fagozom, enzim içeren lizozom ile birleşerek bir fagolizozom oluşturur.

Fagolizozomun içinde, reaktif oksijen türleri ve enzimler conidia'yı bozar.

Canlı hücre görüntüleme sırasında, ilk zaman noktasında, nötrofillerin fagozomu içindeki yoğun kırmızı ve macenta floresan, canlı conidia'nın varlığını gösterir.

Zamanla, macenta floresansın tutulmasıyla kırmızı floresanda bir azalma, nötrofillerin antifungal aktivitesini doğrulayarak conidia'nın bozulmasını gösterir.

Mikroskopi sırasında DsRed ve AlexaFlour 633'ü görselleştirmek için bir mikroskop ısıtıcısını önceden ısıtın ve mikroskobu ve bilgisayarı açın. Daha sonra, görüntüleme kabının uygun kuyucuklarına mililitre FLARE konidiyal süspansiyon başına 10. kez 3 kez 10 mikrolitre ekleyin. FLARE conidia'nın eklendiği zamanı kaydedin.

Görüntüleme kabını mikroskop tablasına monte edin. Ardından, Çekim ayarlarında Lazer Gücü'nü %10'a ve Pozlama Süresi'ni bir saniyeye ayarlayın ve DsRed ve AF 633'ün net ancak aşırı pozlanmamış bir görüntüsü için kamera hassasiyetini ayarlayın ve bir sahne noktaları listesi oluşturun. Tüm noktalar odakta olduğunda, floresan kanalları optimize edildiğinde ve döngü süresi ve süresi ayarlandığında görüntülemeyi başlatın.