CXCR4 ile Etkileşime Giren Ajanların Tanımlanması için Hücresel Bir Test

CXCR4'ü eksprese eden yapışmış insan beyni kanseri hücrelerini içeren jelatin kaplı çok kuyulu bir plaka alın.

Ortamı kalsiyuma duyarlı bir boya ile değiştirin. Hücre içi esterazlar, boyayı kalsiyum iyonlarına bağlanan ve artan floresan sergileyen zar geçirimsiz bir ürüne ayırır.

Boyayı çıkarın, yıkayın ve tampon ekleyin.

Plakayı, CXCR4 ile etkileşime giren bileşik ve kemokin CXCL12 içeren plakalara sahip bir floresan mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.

Ayarlanan otomatik parametreleri kullanarak, artan bileşik konsantrasyonlarını test kuyularına enjekte edin ve ardından belirli bir CXCL12 konsantrasyonu ekleyin.

Bileşik içermeyen kontrol kuyularında CXCL12, CXCR4'e bağlanır.

Bu bağlanma, kalsiyum iyonlarını sitoplazmaya salarak bir sinyal kaskadını aktive eder, burada boyayı bağlarlar ve floresansı yoğunlaştırır.

Bununla birlikte, test kuyularında, etkileşen bileşikler, CXCL12'nin CXCR4'e bağlanmasını inhibe eder, kalsiyum mobilizasyonunu etkiler ve doza bağlı bir floresan azalmasına neden olur ve bunları CXCR4 antagonistleri olarak doğrular.

Hücre geçişi gününde, siyah duvarlı polistiren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunu, 100 mikrolitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile şeffaf diplerle kaplayın ve plakaları oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Jelatin katılaşırken, ilgilenilen hücreleri kültür şişelerinin altından kaldırmak için bir tripsin-EDTA çözeltisi kullanın, hücreleri ayrıldıktan sonra 50 mililitrelik bir konik tüp içinde taze büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze büyüme ortamında mililitre konsantrasyonu başına 1 x 10⁵ canlı hücreye yeniden süspanse edin. Plakalar hazır olduğunda, fazla jelatin çözeltisini atın ve plakaları bir laboratuvar dokusu üzerinde kurutun. Daha sonra, kuyucukları 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve yıkamayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir gece inkübasyon için oyuk başına 200 mikrolitre hücre ile değiştirin.

Ertesi sabah, büyüme ortamını kuyulardan atmak için plakaya hafifçe vurun ve plakayı bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı kurulayın. Daha sonra, her bir oyuktaki hücreleri oyuk başına 100 mikrolitre yükleme boya çözeltisi ile etiketleyin ve plakayı oda sıcaklığında karanlıkta 45 dakika inkübe edin. Hücreler inkübe edilirken, kemokin plakasına oyuk başına 75 mikrolitre CXCL12 ve bileşik plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre ilgilenilen bileşik ekleyin.

Ardından, floresan plaka okuyucunun soğutucu ünitesini ve ardından plaka okuyucunun kendisini açın. Sistemin başlaması için birkaç dakika izin verdikten sonra plaka okuyucu yazılımını açın. Test protokolünü ayarlamak için, Ayarlar sekmesi altında, Okuma Modu'nu ve yükleme boyası için uygun uyarma ve emisyon dalga boyunu seçin.

Bileşik plakadaki bileşiklerin otomatik olarak karıştırılması için "Transfer Sıvısı ile Karıştır" sekmesini seçin. "Transfer Sıvısı" sekmesinde, ölçüm plakasına aktarılacak bileşik plakadan her bir oyuktan 20 mikrolitre ayarlayın ve pipet uçlarını sıvı yüzeyinin 20 mikrolitre altına yerleştirin. Aspirasyon hızını saniyede 50 mikrolitreye ve dağıtım hızını saniyede 25 mikrolitreye ayarlayın ve "Transfer Sıvısı ile Oku" yu tıklayın.

İlk aralık sırasında, bileşikler ölçüm plakasına dağıtılmadan önce kaydedilecek 10 okuma ve sonrasında tamamlanacak 50 okuma ile bir saniyelik okuma aralığı süresine sahip 60 okuma seçin. 30 saniye ve 18 okuma aralığı süresi ile ikinci aralığı ayarlayın. Protokol için üç uçlu yıkama seçin, her yıkama adımını uygun yıkama sıvısını, bir yıkama döngüsünü, hızlı bir pompa hızını ve yıkama başına beş vuruşu içerecek şekilde ayarlayın.

300 saniyelik bir pipetör duraklaması eklemek için "Pipetleyiciyi Duraklat" işlevini kullanın ve CXCL12 çözeltisinin kemokin plakası içinde otomatik olarak karıştırılmasına izin vermek için "Transfer Sıvısı ile Karıştır" ayarını kullanın. Sonraki "Transfer Sıvısı" sekmesinde, ölçüm plakasına aktarılacak kemokin plakasının her bir oyuğundan 25 mikrolitre ayarlayın ve uçları sıvı yüzeyinin 20 mikrolitre altına yerleştirin. Aspirasyon hızını saniyede 50 mikrolitreye ve dağıtım hızını saniyede 25 mikrolitreye ayarlayın.

İlk aralığı, bir saniyelik okuma aralığı süresiyle 145 okumayı içerecek şekilde ayarlamak için " Transfer Sıvısı ile Oku" düğmesini kullanın. İkinci aralığı altı saniye ve 20 okuma aralığı süresine ayarlayın. Üç yıkama ucu döngüsü daha seçin, ardından "Stage Sıcaklığını Ayarla"ya tıklayın ve cihaz sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Yükleme boyası inkübasyonunun sonunda, tamponu ölçüm plakasından atın ve plakayı bir laboratuvar dokusu üzerinde kurutun. Hücreleri tahlil tamponu kuyusu başına 150 mikrolitre ile yıkayın ve tamponu iki dakika sonra 80 mikrolitre tahlil tamponu ile değiştirin. Ölçüm plakasını okuma konumuna, bileşik plakayı kaynak 2 konumuna, kemokin plakasını kaynak 3 konumuna ve kaynak 1 konumuna bir kutu siyah uç yerleştirin.

Cihazı kapatın ve plaka üzerindeki arka plan bağıl ışık birimlerini ve floresan varyantlarını belirlemek için "Protokol Sinyal Testi"ne tıklayın. Açılır pencerede "Sinyali Test Et"i seçin. 8.000 ila 10.000 bağıl ışık biriminin arka plan değerleri elde edilirse, "Güncelle"yi seçin ve ana protokolü kaydetmek için "Kaydet"e tıklayın.