α-Galaktosidaz A ve Asit α-Glukozidaz Enzim Aktivitesinin İn Vitro Ölçümü

α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz, hücresel metabolizma için çok önemli olan lizozomal enzimlerdir.

α-galaktosidaz A, glikolipidler gibi substratları parçalarken, asit α-glukozidaz glikojeni hidrolize eder.

Enzim aktivitelerini in vitro olarak ölçmek için, sırasıyla bilinen konsantrasyonlarda α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz içeren numunelerle çok kuyulu plaka kuyuları alın.

Kuyucuklara, bu enzimler için doğal substratları taklit etmek üzere tasarlanmış spesifik florojenik substratlar olan sentetik 4-Metilumbelliferil substratların gerekli hacminde asidik çözeltiler ekleyin.

Karanlıkta kuluçkaya yatın.

α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz enzimleri, ilgili substratlarını parçalayarak floresan ürünü olan 4-metilumbelliferonu serbest bırakır.

Enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için bir alkali tampon ekleyin.

Bir mikroplaka floresan okuyucu kullanarak, sırasıyla α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz enzim aktivitesini belirlemek için kuyucuklardaki 4-metilumbelliferonun floresan yoğunluğunu ölçün.

Her numunenin hesaplanan miktarını seyreltin ve mikrolitre çözelti başına 0.05 mikrogram alfa-galaktosidaz A veya 0.5 mikrogram asit alfa-glukozidaz elde etmek için taze 1.5 mililitrelik reaksiyon tüplerine pipetleyin. Numuneleri tekrar 5 saniye boyunca vorteksleyin ve bu seyreltmenin 10 mikrolitresini pipetleyin ve 96 oyuklu bir plakaya çoğaltın.

İlgili substrat çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyerek reaksiyonları başlatın. Alfa-galaktosidaz A için, 0.06 molar fosfat sitrat tamponu, pH 4.7'ye 2 milimolar 4-metilumbelliferil-alfa-D-galaktopiranosid veya 4-MU-Gal ekleyin. Asit alfa-glukozidaz için, 0.025 molar sodyum asetat, pH 4.0 içinde 2 milimolar 4-metilumbelliferil-alfa-D-glukopiranozit veya 4-MU-Glu ekleyin.

Enzim reaksiyonlarını karanlıkta 37 santigrat derece ve 300 RPM'de 1 saat boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Daha sonra 200 mikrolitre 1.0 molar pH 10.5 ayarlı glisin sodyum hidroksit tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Metin protokolüne göre mililitre başına 0.01 miligramlık bir stoktan standart bir 4-MU eğrisi hazırlayın ve 10 mikrolitre çözeltiyi iki kopya halinde 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin.

Hacmi ve pH'ı ayarlamak için her bir oyuğa 200 mikrolitre 1.0 molar glisin sodyum hidroksit tamponu ekleyin. Son olarak, uygun filtre seti ile donatılmış bir floresan okuyucuda enzim aktivitesini ölçün ve floresan okuyucu cihazı için uygun yazılımı kullanarak verileri analiz edin.