Bir Viral İnaktivasyon Testi ile Bir Antiviral Test Bileşiğinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Rekombinant hepatit C virüsü veya salgılanan bir lusiferaz raportörünü kodlayan RNA içeren HCV süspansiyonu olan tüpleri alın.

Teste ve negatif kontrol tüplerine bir antiviral test bileşiği ve çözücü ekleyin.

Test bileşikleri, HCV glikoproteinlerine bağlanarak virüsü etkisiz hale getirir.

İnkübasyon sonrası, sonraki adımlarda bileşik-hücre etkileşimlerini önlemek için karışımları seyreltin.

Bu seyreltilmiş karışımları HCV replikasyonunu destekleyen hepatom tek katmanlarına ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Bileşikle inaktive edilmiş HCV, spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanamazken, aktif HCV glikoproteinleri bu reseptörlere bağlanarak hücresel bağlanmayı kolaylaştırır.

Adsorbe edilmemiş HCV'leri çıkarın. Tampon ile yıkayın ve ortam ekleyin. Uzun süre kuluçkaya yatırın.

Bağlı HCV içselleştirilir, viral RNA'yı serbest bırakır ve hücreden salgılanan viral protein ve lusiferaz sentezine yol açar.

Luciferaz içeren kültür süpernatantlarını toplayın. Santrifüjleyin ve süpernatantlara bir lusiferaz substratı ekleyin.

Lusiferaz, alt tabakayı oksitleyerek ışık yayar.

Kontrol kuyusunda testtekinden daha yüksek bir lüminesans, bileşik tarafından viral inaktivasyonu gösterir.

Viral inaktivasyon testine başlamak için, önce 96 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 1 kez 10 ila dördüncü hücreye plaka koyun. Hücreleri bağlantı için gece boyunca %37 karbondioksit ile 5 santigrat derecede inkübe edin. Enfeksiyon için, metin protokolünde belirtildiği gibi Gaussia lusiferase raportör etiketli hepatit C virüsü veya HCV parçacıklarını hazırlayın.

Steril bir tüpte, 100 mikrolitre 100 mikromolar CHLA veya PUG'yi 100 mikrolitre 10 ila dördüncü odak oluşturan birimlere veya HCV'nin FFU'suna karıştırın. Pozitif bir kontrol için, HCV'yi mililitre başına 1.000 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda heparin ile karıştırın. 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin.

Üç saat sonra, virüs bileşiği karışımını oda sıcaklığında 9.8 mililitre bazal ortam ile 50 kat seyreltin. Daha sonra, yeni bir virüs bileşiği karışımı hazırlayın ve bu karışımı sıfır saatlik inkübasyon numunesi için hemen bazal ortamda seyreltin. İnkübasyon ortamını hücrelerden çıkardıktan sonra, üç kopya halinde oyuk başına 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs ilaç çözeltisi ekleyin.

Çözelti şimdi kuyu başına 10 ila ikinci FFU içerir. Hücrelerin viral enfeksiyonuna izin vermek için üç saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İnkübasyondan sonra, viral süspansiyonu kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri iki kez 200 mikrolitre PBS ile nazikçe yıkayın.

Viral replikasyon ve lusiferaz raportörünün süpernatana salınması için hücreleri 100 mikrolitre bazal ortamda 72 saat inkübe edin. Daha sonra, süpernatanları kültürlerden mikrotüplerde toplayın ve hücresel kalıntıları gidermek için 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 17.000 kez g'de santrifüjleyin. Her süpernatantın 20 mikrolitresini 50 mikrolitre Gaussia lusiferaz tahlil reaktifi ile karıştırın ve bir luminometrede lusiferaz raportör aktivitesinden gelen lüminesansı ölçün.