Test Bileşiklerinin Konakçı Hücrelerde Viral Giriş ve Füzyon Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Test

Karaciğer kanseri hücrelerini alın ve endositozu bozmak için düşük bir sıcaklıkta inkübe edin.

Salgılanan bir lusiferaz raportörünü kodlayan tasarlanmış bir RNA genomu içeren rekombinant bir Hepatit C virüsü veya HCV'yi tanıtın.

Viral lipoproteinler, konakçı hücreler üzerindeki proteoglikanlar ile etkileşime girerken, viral zarf glikoproteinleri spesifik konak reseptörlerine bağlanır.

Seçilen kuyucuklarda, viral glikoproteinlere bağlanan test bileşiğini ekleyin.

Fizyolojik sıcaklıkta inkübasyon üzerine, bağlı virüsler endositoz edilir.

İçselleştirilmemiş virüsleri atın, bir büyüme ortamı ekleyin ve kuluçkaya yatırın.

İşlenmemiş kuyucuklarda, glikoproteinler viral zarf-endozom füzyonuna yardımcı olarak nükleokapsidi serbest bırakırken, bileşik maskeleme tedavi edilen kuyucuklarda füzyonu bozar.

Serbest bırakıldıktan sonra, RNA, hücre dışı olarak salgılanan lusiferaz da dahil olmak üzere viral proteinleri eksprese eder.

Lusiferaz içeren süpernatanı hasat edin ve ışık yaymak için lusiferaz ile oksitlenen bir biyolüminesan substrat ekleyin.

Tedavi edilen kuyucuklarda tedavi edilmeyenlere kıyasla azalmış bir lüminesans, viral zarf-endozom füzyonunun inhibisyonunu gösterir.

Viral füzyonu ve girişi test etmek için, hücre bağlanması için gece boyunca inkübasyondan sonra hücre kültürü plakasını bir saat boyunca 4 santigrat derecede önceden soğutun. Mevcut ortamı kuyulardan çıkarın ve hücreleri buz üzerinde 10 ila ikinci FFU HCV ile enfekte edin.

Plakayı üç saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Yapışmamış virüsü çıkarmak için hücreleri 200 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, buz üzerinde, hücreleri bazal ortamda veya bazal ortamda kontrol olarak% 1 DMSO ile çözünmüş bir test bileşiği ile muamele edin ve plakayı üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu, 37 santigrat derecede meydana gelen viral girişte test bileşiklerinin değerlendirilmesine izin verir.

Ortamı aspire edin ve içselleştirilmemiş virüsleri 200 mikrolitre sitrat tamponu veya PBS ile iki kez yıkayın. Oyuk başına 100 mikrolitre bazal ortam ekleyin ve 72 saat daha 37 santigrat derecede inkübe edin. Süpernatanı toplayın ve serbest bırakılan lusiferaz raportörünü tespit etmek için daha önce gösterildiği gibi Gaussia lusiferaz testini gerçekleştirin.