Modifiye Turnusol Testi Kullanılarak Bakteriyel Bir Biyobelirteçin Kolorimetrik Tespiti

Belirli bir bakteriyel biyobelirteçöre bağlandığında aktive olan bir katalitik DNA olan RNA parçalayan bir DNA ile başlayın.

DNAzyme, 5' ucunda biyotin aracılığıyla streptavidin kaplı bir manyetik boncuk ile bağlanır. 3' ucunda, fonksiyonel bir manyetik boncuk oluşturan oligonükleotid bağlantılı bir üreaza bağlanır.

Fonksiyonel manyetik boncuklar içeren bir tüpe bir E. coli lizat ekleyin.

Lizattan elde edilen spesifik bir E. coli biyobelirteci, DNAzim'i aktive ederek RNA bağlantısının bölünmesini tetikler ve DNAzime-üreaz konjugatının ayrılmasına neden olur.

Boncukları hareketsiz hale getirmek ve boncuk bağlı DNAzime-üreaz konjugatını çıkarmak için manyetik bir stand kullanın.

Serbest bırakılan üreaz içeren süpernatanı başka bir tüpe aktarın.

Bir pH indikatör boyası - fenol kırmızısı ve bir üre çözeltisi ekleyin.

Üreaz, üreyi amonyak ve karbondioksite hidrolize eder.

Zayıf bir baz olan amonyak, çözeltinin pH'ını yükselterek E. coli biyobelirtecinin varlığını gösteren bir renk değişikliğine neden olur.

E. coli hücrelerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 100 mikrolitre RB ekleyerek ve girdaplayarak 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünü önceden yıkayın. Ardından arabelleği atın.

Yıkanmış tüpe 15 mikrolitre monte edilmiş EC1 ekleyin, ardından tüpü manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Tüpü raftan çıkarın, 100 mikrolitre RB ekleyin ve manyetik boncukları dikkatlice yeniden askıya alın.

Boncukları iki kez daha yıkamak için RB kullandıktan ve RB'yi çıkardıktan sonra, tüpe 10 mikrolitre E. coli örneği ekleyin ve tüpün üzerine hafifçe vurarak içeriği hafifçe karıştırın. Ardından, reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, 90 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin ve tüpü manyetik rafa yerleştirin. Yaklaşık üç dakikalık manyetik ayırma işleminden sonra, süpernatanın 85 mikrolitresini dikkatlice 0,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın.

Manyetik boncukların hiçbirini almadan çözeltiyi dikkatli bir şekilde pipetlemek çok önemlidir. Bu boncuklar üreaz ile yüklenir ve yanlış bir pozitif sinyal üretir.

15 mikrolitre% 0.04 fenol kırmızısı ve 100 mikrolitre substrat çözeltisi ekleyin. Ardından, renk değişimini kaydetmek için belirli zaman aralıklarında fotoğraf çekin.