JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:07 dk. • July 8th, 2025
Ateşböceği lusiferaz veya Fluc ve Renilla lusiferaz veya Rluc için kodlayan muhabir mRNA'ları içeren transfeksiyon komplekslerini alın.
Fluc mRNA, bir 5' poliadenozin dizisi veya bir poli(A) lideri içerirken, Rluc mRNA'da bu dizi yoktur.
Raportör mRNA'ları iletmek için enfekte olmamış ve poxvirus ile enfekte olmuş memeli hücrelerini transfekte edin ve inkübe edin.
Enfekte olmamış hücrelerde, ökaryotik başlatma faktörleri mRNA'nın 5' başlığına bağlanır, ardından küçük ribozomal alt birimin ve bir başlatıcı tRNA'nın alınması gelir.
Küçük alt birim başlangıç kodonunu bulduktan sonra, büyük alt birim lusiferaz proteinlerini sentezlemek için birleşir.
Enfekte hücrelerde, küçük alt birimin poxvirus aracılı fosforilasyonu, ribozomun doğrudan lider dizi üzerinde toplanmasına neden olarak Fluc üretimini arttırır.
Luciferazları serbest bırakmak için hücreleri parçalayın.
Enzimin oksitlediği ve ışık yayan Fluc substratını ekleyin. Bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçün.
Virüs bulaşmış hücrelerde Rluc'a kıyasla Fluc lüminesansındaki nispi artışı belirlemek için Rluc için adımı tekrarlayın.
Ertesi gün% 80 ila% 90 birleşme elde etmek için HeLa hücrelerini 24 oyuklu bir plakada tohumlayın
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin