Poxvirus ile Enfekte Hücrelerde Translasyon Regülasyonunu İncelemek İçin Bir Luciferase Reporter Testi

Ateşböceği lusiferaz veya Fluc ve Renilla lusiferaz veya Rluc için kodlayan muhabir mRNA'ları içeren transfeksiyon komplekslerini alın.

Fluc mRNA, bir 5' poliadenozin dizisi veya bir poli(A) lideri içerirken, Rluc mRNA'da bu dizi yoktur.

Raportör mRNA'ları iletmek için enfekte olmamış ve poxvirus ile enfekte olmuş memeli hücrelerini transfekte edin ve inkübe edin.

Enfekte olmamış hücrelerde, ökaryotik başlatma faktörleri mRNA'nın 5' başlığına bağlanır, ardından küçük ribozomal alt birimin ve bir başlatıcı tRNA'nın alınması gelir.

Küçük alt birim başlangıç kodonunu bulduktan sonra, büyük alt birim lusiferaz proteinlerini sentezlemek için birleşir.

Enfekte hücrelerde, küçük alt birimin poxvirus aracılı fosforilasyonu, ribozomun doğrudan lider dizi üzerinde toplanmasına neden olarak Fluc üretimini arttırır.

Luciferazları serbest bırakmak için hücreleri parçalayın.

Enzimin oksitlediği ve ışık yayan Fluc substratını ekleyin. Bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçün.

Virüs bulaşmış hücrelerde Rluc'a kıyasla Fluc lüminesansındaki nispi artışı belirlemek için Rluc için adımı tekrarlayın.

Ertesi gün% 80 ila% 90 birleşme elde etmek için HeLa hücrelerini 24 oyuklu bir plakada tohumlayın ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. HeLa hücrelerini Vaccinia virüsü ile 5 enfeksiyon çokluğunda enfekte edin ve enfekte olmamış HeLa hücrelerini karşılaştırma için saklayın, daha sonra plakayı 10 ila 12 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Enfeksiyondan istenen saatler sonra, 480 nanogram 12A dizi taşıyan ateşböceği lusiferaz mRNA'sı ve 20 nanogram Kozak dizi taşıyan Renilla lusiferaz mRNA'yı bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.

Başka bir mikrosantrifüj tüpünde, 1.1 mikrolitre katyonik lipid transfeksiyon reaktifi ekleyin. Her iki tüpe de 55 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha sonra, mRNA içeren tüpe indirgenmiş serum ortamı içeren 55 mikrolitre katyonik lipid transfeksiyon reaktifi ekleyin. Bir pipetle nazikçe ama iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, hücre kültürü ortamını hücrelerden çıkarın ve oyuk başına 400 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ekleyin.

İnkübasyon tamamlandığında, 24 oyuklu plakanın oyuğu başına damla damla ve eşit şekilde 100 mikrolitre karışım ekleyin. 12A-Fluc ve Kozak-Rluc mRNA ile ko-transfeksiyondan 5 saat sonra, indirgenmiş serum ortamını hücrelerden çıkarın ve iki raportör tahlil yapabilen lusiferaz tahlil kitinden 150 mikrolitre 1X lizis tamponu ekleyerek hücreleri parçalayın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, hücreleri kauçuk ve steril şırınga kullanarak kazıyın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Pelet hücresi kalıntıları için, lizatı 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 kez g'de santrifüjleyin. Sağlam bir tabana sahip opak duvarlı 96 oyuklu beyaz bir tahlil plakasının oyuğu başına 30 mikrolitre süpernatan aktarın. El yazmasında açıklandığı gibi kinetik işlevi kullanarak çift lüminesansı ölçmek için çok modlu bir plaka okuyucu luminometrede lusiferaz test kitini kullanın.