Hücre Dışı Matriks Sertliğine Bağlı Bakteri Yayılımını Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi

Değişen sertlikteki kollajen kaplı poliakrilamid hidrojeller üzerinde yapışık insan endotel hücresi tek katmanlarına sahip çok kuyulu bir plaka alın.

Daha sert hidrojeller üzerindeki hücreler, daha yumuşak hidrojellere kıyasla hücre içi gerilimi artırarak önemli hücre iskeleti yeniden yapılanmasına uğrar.

Hücreleri ortamla yıkayın ve aktin montajını indükleyen protein (ActA) promotörü altında bir floresan proteini eksprese eden mühendislik Listeria monocytogenes ekleyin.

Hücre-bakteri temasını kolaylaştırmak için santrifüjleyin. Bakteriyel endositoza aracılık etmek için inkübe edin.

Medya ile yıkayın. İçselleştirilmemiş bakterileri ortadan kaldırmak için gentamisin ile tedavi edin. Kuluçkaya yatmak.

İçselleştirilmiş bakteriler gözenek oluşturan toksinler salarak fagozomal zarları bozar. Sitozolik bakteriler, hücre içi bakterileri etiketleyerek ActA ve floresan protein ekspresyonunu yukarı regüle eder.

ActA proteinleri, aktin polimerizasyonunu indükler, bakterileri ileri iten bir aktin kuyruklu yıldız kuyruğu oluşturur, komşu hücreler tarafından içselleştirmeye neden olur ve yayılmayı teşvik eder.

İnkübasyon sonrası, hücre çekirdeklerini boyamak için boya içeren ortamlar kullanın. Ortamı gentamisin içeren ortamla değiştirin.

Hızlandırılmış mikroskopi gerçekleştirin.

Daha yumuşak hidrojeller, hücre içi gerilimi artan daha sert hidrojellere kıyasla bakterilerin hücreler arası hızlı yayılmasını teşvik eder, bu da matris sertliğine bağlı bakteri yayılımını düşündürür.

Metin protokolüne göre bir gece L. monocytogenes kültürü hazırladıktan sonra, kültürün 1 mililitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.000 kez g ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca döndürün. Peleti iki kez yıkamak için doku kültürü dereceli PBS kullandıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 1 mililitre PBS kullanın.

Enfeksiyon karışımını, konakçı hücre başına yaklaşık 50 bakteri veya konakçı hücre başına 10 bakteriden oluşan çok sayıda enfeksiyon veya MOI için 10 mililitre MCDB-131 tam ortam ile 10 veya 50 mikrolitre bakteri süspansiyonunu birleştirerek hazırlayın. Hidrojelleri veya hücreleri bozmamaya dikkat ederek ortamı 24 oyuklu plakaların kuyularından çıkarın.

Hücreleri bir kez yıkamak için 1 mililitre MCDB-131 tam ortam kullanın, ardından her oyuğa 1 mililitre bakteri ekleyin. Kapağı plakaların üzerine yerleştirin ve sızıntıyı önlemek için polietilen gıda sargısı ile sarın. İstilayı senkronize etmek için plakaları 2.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra kültürleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. MCDB-131 tam besiyeri ile numuneleri 4 kez yıkayın ve doku kültürü inkübatörüne geri koyun. Ek bir 30 dakika sonra, ortamı mililitre gentamisin başına 20 mikrogram ile desteklenmiş MCDB-131 tam ortamı ile değiştirin.

HMEC-1 hücrelerini PA hidrojeller üzerine ektikten ve metin protokolüne göre gentamisin ile işlemden geçirdikten sonra, ActA promotörünün, mTagRFP açık okuma çerçevesinin ifadesini açmasına ve sürmesine izin vermek için plakayı beş saat inkübe edin.

Enfeksiyondan dört saat sonra, 1 mikrolitre 1 mg / ml Hoechst boyasını 1 mililitre L15 tam ortam ile karıştırın ve çekirdekleri boyamak için her bir oyuğa ekleyin. Hücreleri 10 dakika inkübe ettikten sonra, ortamı mililitre gentamisin başına 20 mikrogram ile takviye edilmiş 1 mililitre L15 tam ortam ile değiştirin.

LM bakterilerinin değişen sertlikteki hidrojeller üzerine ekilen HMEC-1 tek katmanlarından nasıl yayıldığını izlemek için otomatik odaklama özelliğini kullanarak her 5 dakikada bir birden fazla konumu görüntüleyin.