JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 2:48 dk • July 8th, 2025
Antiviral bir ilaçla tedavi edilmiş enfekte bir domuz korneasından elde edilen virüs içeren bir örnekle başlayın.
Azalan virüs konsantrasyonlarının bir dizisini oluşturmak için numunenin seri seyreltmesini gerçekleştirin.
Optimum seyreltme, birden fazla virüsün neden olduğu tek hücreli enfeksiyonu önler.
Seyreltilmiş numuneleri bir konak hücre tek tabakasına yerleştirin ve inkübe edin.
Virüs, konak hücre reseptörüne bağlanır, hücreye girer ve replikasyonunu başlatır. Enfekte hücre parçalanır ve viryonları serbest bırakır.
Virüsleri yakındaki hücrelerle sınırlayan viskoz bir madde olan metilselüloz ekleyin.
Daha sonra, virüsler enfekte bölgede hücre ölümüne ve plak oluşumuna neden olur.
Hücreleri sabitlemek için metanol ekleyin.
Canlı hücreleri boyamak için kristal viyole kullanın.
Plakları, kristal viyole lekeli enfekte olmamış hücrelerle çevrili, enfekte olmuş hücreleri ve hücre ölümünü gösteren açık bölgeler olarak gözlemleyin.
Son olarak, antiviral ilacın etkinliğini belirlemek için başlangıç çözeltisindeki virüs titresini ölçmek için en yüksek seyreltmedeki plakların sayısını sayın.
Her korneadan toplanan virüs miktarını ölçmek için, 1 x 10-8'lik bir seyreltmeye ulaşılana kadar mikrosantrifüj tüplerinde serumsuz ortamda virüsün bir log10 bir kat seyreltmesini hazırlayın.
Büyüme ortamını her bir hücre oyuğundan aspire ettikten sonra, 1 x 10'dan başlayarak her virüs seyreltmesinin 1 mililitresini aktarın-3 ve enfekte olmuş hücreleri iki saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, 72 saatlik bir inkübasyon için veya plak oluşumu gözlenene kadar her bir oyuğa 2 mililitre metilselüloz yüklü ortam eklemeden önce her bir kuyucuğu PBS ile 2 kez nazikçe yıkayın.
Plak gözleminden sonra, oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğun köşesine yavaşça 1 mililitre metanol ekleyin. İnkübasyonun sonunda, hücre tek tabakasını bozmadan içeriği her bir oyuktan yavaşça aspire edin.
Daha sonra, her bir kuyucuğu 1 mililitre kristal viyole çalışma solüsyonu ile etiketleyin ve tüm hücrelerin ışıktan korunan 30 dakikalık bir inkübasyon için kaplanmasına dikkat edin. Kuluçka işleminin sonunda, çözeltiyi atın ve kuyuları bir emici kağıt tabakası üzerinde kurutun. Ardından, başlangıç solüsyonundaki toplam virüs içeriğini 3 kez ölçmek için en yüksek seyreltme kuyusundaki plak sayısını sayın.