Virüsle Enfekte Hücrelerde Polimikrobiyal Biyofilm Başlangıcını Belirlemek İçin Bir Test

Memeli hücre tek katmanlarını içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Herpes simpleks virüsü ile tohum test kuyuları. Kontrol kuyuları virüsten yoksundur.

Virüs, hücre yüzeyi heparan sülfatına bağlanır ve endositoz yoluyla içselleştirilir.

Virüs enfeksiyonu, heparan sülfatı parçalayan ve spesifik mantar reseptörlerini maskeleyen heparagonaz salgılanmasını tetikler.

Hücreleri Staphylococcus aureus ve Candida albicans germ tüpleri ile birlikte inkübe edin.

Virüsle enfekte olmuş hücrelerde, heparan sülfat tükenmesi, mantar reseptör etkileşimlerini teşvik ederken bakteriyel-fungal ko-lokalizasyonunu önlerken bakteriyel etkileşimi inhibe eder.

Kontrol hücrelerinde bakteriler heparan sülfat ile etkileşime girerken, mantarlar mevcut reseptörlere bağlanır.

Bu mikrobiyal ko-lokalizasyon, biyofilm oluşumunun ilk adımı olan uyumu başlatır.

Kuluçka sonrası, bağlanmamış mikropları çıkarın. Ortama bakteri ve mantar salarak bir lizis tamponu ile kaplayın.

Hücre lizatını büyüme ortamı içeren plakalara yayın. Koloni oluşumu için kuluçkaya yatırın.

Bakteri kolonilerinde bir azalma ve buna karşılık gelen mantar kolonilerinde bir artış, bakteriyel-fungal ko-lokalizasyonunun ve biyofilm başlangıcının virüs kaynaklı inhibisyonunu gösterir.

Bir polimikrobiyal biyofilm tahlili yapmak için, 96 oyuklu plakaları 200 mikrolitre ile 2 çarpı 10 ila mililitre başına 5. HeLa hücresi ile tohumlayın. Plakaları 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika sallayın, ardından 5 santigrat derecede 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. Tek katmanları yıkamak için optimum 1 kat kullanın. Daha sonra, tek bir HSV suşu ile tohumlayın. Bir seferde yalnızca bir suşu test edin.

Plakaları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde üç saat boyunca inkübe edin. Magnezyum ve kalsiyum içeren 100 mikrolitre 37 santigrat derece PBS kullanarak, enfekte olmuş tek katmanları yıkayın. Ardından, PBS'yi değiştirmek için 37 santigrat derece HBSS kullanın. Her kuyucukta 25 mikrolitre HBSS bırakın.

Daha sonra, GT ve/veya S. aureus çalışma süspansiyonlarını ekleyin ve plakaları 37 santigrat derecede %5 karbondioksit içinde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir seferde plakanın bir sütununu aspire edin. Hemen 300 mikrolitre PBS'yi magnezyum ve kalsiyum ile doldurun.

Bu yıkama adımını iki kez tekrarladıktan sonra, her bir oyuka 1 ila 50 seyreltme filtreyle sterilize edilmiş RIPA lizis tamponunda 200 mikrolitre ekleyin.

Diğer bakteri veya mantar türleriyle çalışırken, kullanılan RIPA konsantrasyonunun hücre lizizi için yeterli olduğundan, ancak yine de mikrobiyal canlılık testi için izin verildiğinden emin olun.

HeLa hücre lizatını hızla tritüre edin ve 50 mikrolitreyi mannitol tuzları ve / veya mantar öldürücü ortam üzerine pipetleyin. Daha sonra, 90 derecelik bir açıyla bükülmüş bir cam çubuk kullanarak, lizatı plakanın yüzeyine yayın.

Plakaları 18 saat inkübe ettikten sonra, plaka başına koloni sayısını manuel olarak sayın. Kontroller S. aureus ve/veya C. albicans'ın HSV ile enfekte olmamış HeLa hücrelerine yapışmasından oluşur.