Lenfoma hücresinin bir test ilacına duyarlılığında nötrofil benzeri hücrelerin rolünün belirlenmesi

Bir bazal membran matrisinde lenfoma hücrelerinin 3D sferoid monokültürlerini, kanserli beyaz kan hücrelerini ve lenfoma ve nötrofil benzeri hücrelerin ko-kültürlerini içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Hücre içi tübüline bağlanan ve mikrotübül polimerizasyonunu bozan ve hücresel apoptozla sonuçlanan bir test ilacı ekleyin.

Ko-kültürde, doğrudan lenfoma hücresi teması, nötrofil benzeri hücreleri aktive ederek sitokin sekresyonunu indükler.

Bu sitokinler, lenfoma hücre reseptörleri ile etkileşime girerek aşağı akış sinyal kaskadlarını tetikler ve anti-apoptotik protein ekspresyonunu yukarı regüle ederek hücre sağkalımını destekler.

Medyayı atın. Hücresel yapışmayı bozmak için bir ayrışma tamponu ekleyin.

Sferoidleri kazıyın ve çalkalama altında inkübe edin. Süspansiyonu tüplere aktarın ve tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak için çalkalamaya devam edin.

Lenfoma ve nötrofil benzeri hücreleri etiketleyen florofor konjuge bir antikor kokteyli tanıtın.

Apoptotik ve ölü hücreleri etiketlemek için florofor etiketli annexin V ve propidyum iyodür ekleyin.

Akış sitometrisi kullanarak, ko-kültürde artmış lenfoma hücresi sağkalımını tespit edin, bu da ilaca karşı nötrofil aracılı korumayı gösterir.

Bir 3D ko-kültür oluşturmak için, tek başına 50.000 RL lenfoma B hücresi ekleyin veya steril 15 mililitrelik tüplerde HL60 ile farklılaşmış hücrelerle karıştırın.

Numuneleri döndürün ve 1 mililitrelik bir pipet ucu kullanarak 300 mikrolitre bazal membran matrisinde peletleri yeniden süspanse edin ve açıklığı 2 ila 3 milimetreye kadar kesin. Daha sonra, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 300 mikrolitre hücreyi 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 1 mililitre tam RPMI ortamı ekleyin ve her iki günde bir orta değişikliklerle yedi gün daha inkübatöre 3D kültürlere geri dönün. 5. günde, kültürlere 10 nanomolar vinkristin ekleyin.

Bir haftalık kültürden sonra, ortamı aspire edin ve her bir kuyuyu 1 mililitre buz gibi soğuk PBS ile 2 kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 3 mililitre EDTA'lı buz gibi soğuk PBS ekleyin ve jelleri ayırmak için kuyuların dibini 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile kazıyın. Plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe çalkalayın. Ardından, 30 dakika daha buz üzerinde hafifçe çalkalamak için hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı steril 15 mililitrelik tüplere aktarın.

Homojen bir hücre süspansiyonunun görünümünü onaylayın. Ardından, hücreleri döndürün, ardından bir PBS yıkaması yapın ve peletleri FBS ile taze PBS'de yeniden süspanse edin. Son olarak, hücreleri az önce gösterildiği gibi uygun antikorlar ve canlılık boyaları ile etiketleyin ve RL ve HL60 ile farklılaşmış hücreleri, gösterilen geçit stratejisini kullanarak akış sitometrisi ile analiz edin.