Name: IGY Teknoloji: Yumurta Sarısı Tavuk Antikorlar çıkarımı Polietilen Glikol (PEG) Yağış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Öğrenin, polietilen glikol çöktürme yöntemiyle yumurta sarısından IgY antikorlarının izolasyonunu. Bu basit ve uygun maliyetli protokol, immünoloji araştırmalarında yüksek verimli antikor üretimi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından hibe tarafından desteklenmiştir (Proje BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und I dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]) . Biz mükemmel teknik yardım B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) teşekkür ederim.

1. Protokol - PEG-yağış yoluyla IGY çıkarma Şekil 1 IGY-çıkarma prosedürünü bir şema verir (bkz. Tablo 2). Protokol ilk Polson ve ark tarif edilmiştir. 1980. Tüm adımları lateks eldiven kullanılarak yapılmalıdır. <ol><li> Kabuğu dikkatlice çatlak ve yumurta sarısı, mümkün olduğu kadar beyaz yumurta gibi ortadan kaldırmak amacıyla "sarısı kaşık" aktarılır. </li><li> Yumurta sarısı, bir filtre kağıdı aktarılır ve geri kalan yumurta akı kaldırmak için atılırsa, daha sonra yumurta sarısı deri bir neşter veya benzer bir alet (pipet) ile kesilir. Yumurta sarısı, 50 ml'lik bir tüp içine dökülür ve yumurta hacmi (V1) kayıtlıdır. </li><li> Iki kez PBS yumurta sarısı hacmi toplam hacminin sarısı (ΣV1 + V2) ve daha sonra% 3.5 PEG 6000 (gram toz haline getirilmiş) ile karıştırılarak eklenir ve vortekslenmiş, yuvarlanan bir karıştırıcı üzerinde yuvarlanan 10 dakika ile takip ediyor. Ekstraksiyon prosedürü bu adımı iki aşamalı olarak süspansiyon ayırır. Bir faz "yumurta sarısı katıların ve yağlı maddeler" (Polson ark orijinal tırnak 1980) ve IGY ve diğer proteinleri içeren bir sulu faz oluşur. </li><li> Tüpler santrifüj 4 ° C de 20 dakika (10.000 rpm 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR + sabit açılı rotor göre). Süpernatant (V3) katlanmış bir filtre üzerinden dökülür ve yeni bir tüpe aktarılır. </li><li> % 8.5 gram (yeni birime göre hesaplanan) PEG 6000, tüp vortekslenmiş ve 3. adımı olarak bir haddeleme mikser atılırsa. </li><li> Süpernatantı atılır farkı ile 4. adımı yineleyin. </li><li> Pelet dikkatli bir şekilde, bir cam çubuk ve vortexer yardımıyla 1 ml PBS içinde çözülür. PBS, son hacim 10 ml (V4) eklenir. Çözüm% 12 PEG 6000 (w / v, 1.2 gram) ile karıştırılır ve adım 3 (vorteks, haddeleme mikser) gibi tedavi edilir. </li><li> 6. adımı tekrarlayın ve 800 ul PBS dikkatle pelet (cam çubuk ve vorteks) çözülür. Kaybolur ve daha sonra bir diyaliz kapsül (pipet) özü aktarmak için hava kabarcıkları için bekleyin. Tüp 400 ul PBS ile durulayın ve diyaliz cihazı (V5) sesi eklemek. (Diyaliz cihazları ve membranlar hazırlanması için eke bakınız.) </li><li> Ekstresi,% 0.1 serum fizyolojik (1.600 ml), gece boyunca diyaliz ve manyetik karıştırıcı yardımıyla hafifçe karıştırılır. Ertesi sabah, tuzlu su, PBS tarafından değiştirilir ve başka bir üç saat için diyaliz. </li><li> Daha sonra bir pipetle IGY özü diyaliz kapsül çekti ve 2ml tüpleri transfer. Son hacmi 2 ml (V6) civarındadır. </li><li> Örneklerinin protein içeriği (mg / ml), 280 nm (PBS ile seyreltilmiş 1:50) (bkz. Şekil 2) fotometrik olarak ölçülür ve IGY bir nesli için 1.33 katsayısı ile Lambert-Beer kanununa göre hesaplanır, Şekil . 4 hazırlık kalitesi (saflık ve kurtarma yaklaşık% 80) gösterir. </li><li> ° C (-70 ° C'de numunelerin donma yok) -20 alikotları örnekleri saklamak için tavsiye edilir. </li><li> Son hazırlıklarını kalitesi vallahi protokolü açıklandığı gibi basit SDS-PAGE ile analiz edilir <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. Ek-önce diyaliz çanta üreticisinin tavsiyelerine göre aşağıdaki şekilde hazırlanmalıdır kullanabilirsiniz: <ol><li> 20 diyaliz torbalar 30 cm parçalar halinde kesilir ve 2000 ml cam beher verilmiştir. </li><li> 5 mM EDTA çözüm 1.750 ml eklenir. </li><li> Bir cam huni, çanta çanta EDTA çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olmak için üstüne yerleştirilir. Çözüm ısıtılır ve 5 dakika (sıcak plaka) kaynatılır. Çözüm dekante ve çanta, üç kez distile su ile yıkanır. </li><li> 1.750 ml EDTA çözüm Bir kez daha eklenir, 5 dakika süreyle kaynatılır ve yukarıdaki gibi distile su ile üç defa yıkanır. </li><li> Son olarak, diyaliz çanta, distile su içinde 10 dakika kaynatılarak ve 4 saklanır ° C Steril cımbız vasıtası ile diyaliz torbaları çıkartın. </li></ol> 3. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Polson ark orijinal açıklamasına göre polietilen glikol yağış yoluyla IGY çıkarma şematik. 1980 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">daha büyük bir resim görmek için buraya tıklayın.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 yaş bağımlılığı aşı tavuk yumurta sarısı toplam IGY Geliştirme. Toplam IGY / yumurta ve SD (n = 4 yumurtacı tavukların) haftalık ortalama verilmiştir. [Pauly 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Layidört farklı antijen ile aşılanan tavukların ng kapasite izlenmesi. Oklar aşılama tarihi ([Pauly 2009]) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">burada daha büyük bir resim görüntülemek için tıklayın.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 azaltarak koşulları altında farklı yumurtaları tek tek IGY hazırlıkları Poliakrilamid-Gelelectrophoresis Lane 1 - Moleküler ağırlık marker, Lane 2 - IGY standardı 3-5 Lane - protokolünde açıklandığı gibi farklı IGY örnekleri hazırladı. Bu protokolün 10. adıma göre son hazırlıklarını. HC - ağır zincirleri, LC - ışık chaines,? - Yaklaşık 35 kDa (muhtemelen vitellogeninin II habercisi C-terminal parçası, [Klimentzou ve ark, 2006]) molekül ağırlığına karşılık gelen küçük kirleri. <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> Tavuk 21 (Antijen A) </td><td> Tavuk 22 (Antijen A) </td><td> Tavuk 19 (Antijen B) </td><td> Tavuk 23 (Antijen C) </td></tr><tr><td> Yumurta sayısı (toplam IGY) 1, 2 yıllık bir süre </td><td> 625 (38 gr) </td><td> 626 (38 g) </td><td> 545 (33 gr) </td><td> 608 (37 g) </td></tr><tr><td> Yumurta sayısı (toplam IGY), ilk yıl </td><td> 345 (20 g) </td><td> 304 (16 g) </td><td> 326 (18 gr) </td><td> 308 (17 gr) </td></tr><tr><td> Yumurta sayısı (toplam IGY), ikinci yıl </td><td> 280 (18 gr) </td><td> 322 (21 gr) </td><td> 219 (15 gr) </td><td> 300 (20 g) </td></tr><tr><td> % Max. mümkün yumurta sayısı (ilk yıl) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % Max. mümkün yumurta sayısı (ikinci yıl) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> işlenmiş yumurta sayısı </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 toplam IGY miktarı ortalama değer Şekil 2 verilerine göre yumurta başına 60 mg protein, yumurta sayısı çarpılarak hesaplanır . 2 max. mümkün yumurta sayısı yılda damızlık bir bilgiye göre 325. Tablo 1. İki yıl farklı antijen ile aşılanan tavukların yumurtlama kapasitesinin istatistikleri. (Şekil ayrıca bkz 3) iki yıl boyunca farklı antijenlerin yanı sıra IGY-sonuç aşıdan sonra en fazla dört tavuk yüzde kapasite Döşeme, [Pauly 2009]) . <table border="1"><tbody><tr><td> Yumurta Nr. </td><td> Tavuk Nr. Tarihi Döşeme </td><td> V1 [ml] sarısı </td><td> V2 [ml] PBS </td><td> 1. PEG Prec. [G] </td><td> Cilt [ml] </td><td> 2. PEG Prec. [G] </td><td> Topak </td><td> 3. PEG Prec. [G] </td><td> Topak </td><td> Cilt [mL] </td><td> Total protein mg / ml </td><td> Düzeltilmiş toplam protein mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> % 3,5 w / v] ΣV1 + V2 </td><td> Prec. centrif. ve filtrasyon V3 </td><td> % 8,5 w / v] V3 </td><td> V4 ml PBS içinde çözünmüş </td><td> % 12 [w / v] V4 </td><td> Ml PBS V5 Çözünmüş </td><td> PBS V6 karşı diyalizden sonra </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1.33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1,58 </td><td> 31 </td><td> 2,63 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 35,0 </td><td> 26,3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1,37 </td><td> 25 </td><td> 2,12 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 28,8 </td><td> 21,6 </td></tr></tbody></table> Tablo 2 PEG yağış Örnek protokol

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

Landesamt kürk Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03) tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Uygun bir IGY arıtma yönteminin seçimi (laboratuar veya endüstriyel) arıtma, maliyet etkinliği, teknoloji (laboratuar ekipmanları), çevre (atık yönetimi) üzerindeki etkisi ve ölçek etkilenir. Çeşitli IGY çıkarma yöntemleri De Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, gözden geçirme için de Schade ve ark 2005) tarafından ayrıntılı olarak incelendi. Genel olarak, bu yöntemler üç temel gruba ayrılabilir: <ol><li> Yağış yöntemleri içeren amonyum veya sodyum sülfat, polietilenglikol (PEG), kaprilik asit ve caragenean. </li><li> Kromatografik yöntemler: afinite kromatografisi, iyon değiştirme kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografi, thiophylic etkileşim kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi. </li><li> Ultrafiltrasyon. </li></ol> IGY bir hazırlık saflık yöntemlerinin bir kombinasyonu ile artış olabilir; örneğin, PEG yağış afinite kromatografisi ile kombine edilebilir. Bazı durumlarda, nihai uygulama bağlı olarak, IGY su ekstraktı (Akita &amp; Nakai 1993) iyi sonuçlar elde etmek için yeterli olacaktır. Deneyimlerimize göre, PEG-yağış elde IGY örnek çok farklı immünolojik testlerin bir çok iyi çalıştı. PEG çöktürme yöntemi standartlaştırarak bir teknik asistan, 4 ve 7 gr haftada arasında toplam IGY bir miktar karşılık gelen yaklaşık 84 yumurta, haftada süreci mümkün. Basit bir hesaplama: Bir yumurta tavuğu bir antijen ile aşı. Birkaç artırmak aşılar sonra tavuk, 30 günlük bir süre boyunca 1:50,000 bir titreye sahip özel antikorlar (Ab) üretir. 30 yumurta x 2 ml IGY ekstraktı (bkz. protokolü ve Şekil 3) 3.000 l anlamına da 3.000 l Ab-seyreltme (bir kova kapasitesi 10 l) karşılık gelen 60 ml toplam IGY, karşılık gelen Ab çözüm 300 kova dolu olabilir. Yani, böyle büyük Ab-miktar, sürekli kalite ve özgünlüğü bir Ab-havuzu saklamak için hiç sorun değil. Bu teknik, aksi polyspecific Ab gözlenen şarj / çok değişkenlik azaltır. Hiçbir memeli kompleman sistemi aktivasyonu, HAMA (insan anti-fare antikor), romatoid faktörler ya da insan kan grubu antijenleri (heteroagglutinins eksikliği) ile çapraz reaktivite: miktar yönü rağmen, IGY Ab memeli IgG ile karşılaştırıldığında daha fazla avantajlara sahip olacaksınız. IGY-Ab olağanüstü bir avantaj olarak adlandırılan bir filogenetik mesafe. Filogenetik mesafe aynı aşı bile, sık sık açıklanan memeliler ve tavukların Ab özgüllükleri arasındaki farklılıkların nedeni budur. Memeli ve kuş bağışıklık sisteminin kendilerini arasındaki farklılıklara ek olarak, bu iki hayvan sınıflarına filogenetik gelişim farklılıkları, farklı Ab özgüllükleri katkıda bulunur. Bazı yazarlar, tavuk genellikle daha verimli tavşan (inceleme için Schade et a. 2005) daha filogenetik son derece korunmuş memeli protein veya peptit karşı Abs üretmek bildirdin. Bunun bir sonucu olarak, korunmuş antijen tavşan bağışıklık sistemi için &quot;maskeli&quot; kalır ve böylece sadece zayıf ya da &quot;sessiz&quot; yanıtı neden. Ayrıca, tavuk ve tavşan aynı memeli antijen ile aşı eğer çok sık tavuk nadiren tavşan elde edilebilir bir Ab-özgüllük ile yanıt. Ab, yumurta sarısı çıkarılan non-invaziv olduğundan hayvan refahı açısından önemlidir. Gen-Gun (plazmid) aşılama ile kombine IGY üretim (Witkowski ve ark 2009) tamamen non-invazif. Sonuç olarak, tavuk ve PEG-yağış yoluyla IGY çıkarma Ab üretimi çok düşük maliyetli ve istikrarlı titreleri kadar 1:1,000,000 son derece spesifik Ab sonuçlar. Kuşlar ve memeliler arasında filogenetik mesafe nedeniyle, tavuk, örneğin tavşan aksine son derece korunmuş memeli antijenlere karşı spesifik Ab üretmek mümkün. IGY teknolojisi ile elde edilen Ab olağanüstü miktarda terapötik / profilaktik amaçlı insan ve veteriner tıp IGY-Ab kullanmak için de kapıyı açar.

<ol><li> -14 KD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya kesti Çanta Visking Tipi 27/32, Diyaliz </li><li> Falcon tüpleri Blue Max, 50 ml Polipropilen Konik Tube, Becton Dickinson Laboratuvar Franklin Lakes NY, ABD </li><li> Katlanmış Filtre MN 615 ¼ ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya Heraeus </li><li> Manyetik karıştırıcı, Variomag Mono, H + P LABORTECHNIK AG, Oberschleißheim, Almanya </li><li> Micro-Diyaliz Kapsül 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya </li><li> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, Almanya </li><li> Fotometre UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Almanya </li><li> Polietilen Glikol 6000, Rotipuran Avrupa Farmakopesi, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya </li><li> Premix PBS-Tampon 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almanya </li><li> Rulo Mikser SRT2, Stuart, Staffordshire, İngiltere </li><li> Vibrofix VF2 Janke &amp; Kunkel, IKA-LABORTECHNIK, Staufen i.Br., Almanya </li><li> Yumurta sarısı kaşık, Fackelmann (houshold etkiler), Almanya </li></ol>

igy teknoloji: yumurta sarısı tavuk antikorlar çıkarımı polietilen glikol (peg) yağış

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Tavuklar (Musculus pektoralis, sol ve sağ, enjeksiyon hacmi 0.5-1.0 ml) im aşılama yoluyla veya plazmid Gen-Gun-bağışıklama yoluyla aşı olabilir. Antijen immünojenite bağlı olarak, yüksek antikor titreleri (1:100,000 - 1:1,000,000) sadece bir veya 3 sonra elde edilebilir - 4 artırmak aşılar. Normalde, bir tavuk, bundan sonra döşeme kapasitesi azalır, yaklaşık 72 hafta boyunca sürekli olarak yumurta bırakır. Bu protokol sayesinde bir yağış prosedürü (PEG. Polson ve ark 1980), yumurta sarısı toplam IGY çıkarma açıklamaktadır . Bu yöntem, iki önemli adımlar içerir. Bunlardan birincisi Lipidlerin kaldırılması ve ikinci bir adım süpernatant toplam IGY yağış. IGY özü bir yıldan fazla bir tamponu (PBS normalde) karşı diyaliz sonra -20 ° C&#39;de saklanabilir. Özü saflık yaklaşık% 80, toplam IGY başına yumurta yumurta tavuğu yaşına bağlı olarak, 40-80 mg arasında değişir. 80 mg / yumurta (PEG yağış ile ilgili) yaklaşık 40 mg / yumurta tavuk yaşı ile toplam IGY içeriği artar. Yılda bir tavuk döşeme kapasitesi yaklaşık 325 yumurta. 60 mg toplam IGY / yumurta (bkz. Tablo 1) ortalama IGY içerik dayalı toplam 20 g IGY / yıl toplam potansiyel bir hasat anlamına gelir.

Bu protokol, polietilen glikol yağış yoluyla, özellikle yumurta sarısı toplam IGY çıkarma açıklar ve, IGY teknolojisi hakkında genel bilgi verir.

IGY Teknoloji: Yumurta Sarısı Tavuk Antikorlar çıkarımı Polietilen Glikol (PEG) Yağış

Tavuklar, i.m. aşılama (Musculus pectoralis, sol ve sağ, enjeksiyon hacmi 0,5-1,0 ml) veya Gene-Gun aracılığıyla immünize edilebilir...

Bu video, gen gum, plazmid ile veya daha geleneksel bir yöntem olan intramüsküler enjeksiyon yoluyla immünize edilebilen tavuklardan IGY antikorlarının izolasyonunu gösterecektir. İlk olarak yumurta sarısı izole edilir. Ardından lipidler çöktürülür ve bunu takiben antikorları içeren bir protein fraksiyonu çöktürülür; bu antikorlar daha sonraki bir çöktürme adımında izole edilir.Son olarak, antikorlar PBS ile diyalize edilir. Evet. Merhaba. Benim adım Ard. Bu da meslektaşım Adema; bizler, Berlin SHA Tıp Üniversitesi'ne bağlı olan oldukça eski ve ünlü Farmakoloji Enstitüsü'nde çalışıyoruz.Aşağıda, tavuk yumurtasından ve yoğurttan IGY ekstraksiyonunu gerçekleştireceğimiz, oldukça basit ve aynı zamanda çok düşük maliyetli olduğunu düşündüğünüz bir yöntemi göstermek istiyoruz. Tüm bunlar, sözde IGY teknolojisi kapsamında yer almaktadır. IGY hazırlamanın ilk adımı, yumurta sarısının izole edilmesidir.Bu prosedür için tüp raflarına, mavi kapaklı filtre kağıtlarına, pipet ucu tamponuna, bir cam behere, sarısını beyazından ayırmak için bir sarı kaşığına ve elbette yumurtalara ihtiyacımız vardır. Yumurta akının boşalması için yumurta, sarı kaşığının üzerinde kırılır. Ardından, yumurtayı içeren sarı kaşığı, yumurta akının büyük bir kısmını uzaklaştırmak için nazikçe sallanır.Yumurta akı proteinlerini mümkün olduğunca tamamen uzaklaştırmak için yumurta sarısı ardından filtre kağıdına alınır. Yumurta zarı, saklama süresi üç ayı geçmeyen ve bir aydan daha eski olmayan yumurtalarda oldukça stabildir. Filtre kağıdı üzerinde yuvarlama işlemi sırasında, yaşlanma sürecine bağlı olarak yumurta sarısı zarı yırtılabilir.Ardından, yumurta sarısı zarı bir pipet ucuyla açılır ve bir tüpe aktarılır. Son olarak, yumurta sarısının yaklaşık 15 milliliters hacme sahip olduğunu görürsünüz. Bu hacim, yetişkin bir yumurtacı tavuk için normaldir ve sadece çok az değişkenlik gösterir.Yumurta sarısı hacmi kaydedilir. Yumurta sarısındaki lipidlerden IGY dahil olmak üzere yumurta sarısı proteinlerini ayırmak için PBS tamponu içinde çöktürücü olarak %3,5 Polietilen glikol kullanılır; nihai yumurta sarısı ve tampon hacminin %3,5'ine karşılık gelen 1,58 gram polietilen glikol bir teraziyle tartılır. 15 mililitre yumurta sarısı, kendi hacminin iki katı kadar PBS tamponu ile karıştırılır, böylece toplam 45 mililitre nihai hacim elde etmek için 30 mililitre PBS eklenir. Ardından karışıma polietilen glikol eklenir.Tüp kapatılır ve ardından 20 ila 30 saniye boyunca iyice vorteksle karıştırılır. Tüp periyodik olarak ters yüz edilir. Vorteksleme işlemi sırasında.Vorteksleme işleminden sonra, yumurta sarısı tamamen süspansiyon haline gelmiş olmalıdır. Tüpler şimdi 10 dakika boyunca bir rulo karıştırıcıya yerleştirilir. Sonuç, rengi sarıdan açık sarıya dönmüş homojen bir karışımdır.Şimdi karışım 20 dakika boyunca santrifüj edilir. Santrifüjleme işlemi; IGY ve diğer proteinleri içeren berrak bir süpernatant ile esas olarak lipidlerden oluşan sarı bir çökeleği birbirinden ayırır. Bir sonraki adımda, süpernatant katlanmış bir filtreden süzülerek yeni bir tüpe aktarılır.Yeni hacim kaydedilir ve çökelek atılır. Şimdi, süpernatana yeniden, nihai konsantrasyonu 12% olacak şekilde polietilen glikol eklenir. Bu, ilk çöktürmedeki 3.5% ile sonuçlanan SNAT hacminin 8.5%'sinin eklenerek toplamda 12% elde edilmesi anlamına gelir. Ardından çözelti, daha önce olduğu gibi bir rulo karıştırıcıda inkübe edilerek karıştırılır ve 20 dakika boyunca santrifüj edilir. Bu aşamada, polietilen glikol IGY'yi ve diğer proteinleri çöktürür.Bu santrifüj adımından sonra, pelet çözündürme hazırlığında kullanılacaktır. Çubuklar kururken, pelet cam çubukları %70 ethanol ile dezenfekte edilir ve S süpernatanı atılır. Ardından, süpernatanın geri kalanının boşaltılması için tüp ters çevrilir.Ardından pellet'e bir mililitre PBS eklenir. Pellet, iyice vortekslemekle birlikte cam çubuk kullanılarak çözülür. Şu an hafif sarı renkli bir çözelti görmektesiniz.Şimdi, son hacim 10 mililitre olacak şekilde PBS eklenir ve ardından, ikinci santrifüjle karşıt olarak, daha önce olduğu gibi %12 konsantrasyonda üçüncü bir polietilen glikol çöktürmesi uygulanır. Bu kez 20 dakikalık santrifüj sonrası beyaz bir çökelek elde edilir. Pelet, daha önce olduğu gibi ancak iki aşamada çözülür.İlk adımda, 0.8 milliliters PBS içinde çözülür ve bir mikrodiyaliz kapsülüne aktarılır. Ardından tüp, yine kapsüle aktarılan ek 0.4 milliliters PBS ile durulanır. Bir sonraki adımda, dezenfekte edilmiş makasla bir diyaliz torbası kesilir ve distile su ile durulanır.Ardından diyaliz torbası kapsülün alt kısmına yerleştirilir ve üst kısım tarafından sıkıca kapatılır. Son olarak, kapsüller manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirilmiş cam bir behere aktarılır. IGY çözeltisi, %0.1'lik salin karşıtıyla gece boyuncale diyaliz edilir.Ertesi gün, IGY çözeltisi üç saat boyunca PBS karşıtında diyalize edilir. Diyaliz işlemi tamamlandıktan sonra, diyaliz membranı bir pipet ucuyla delinir ve IGY çözeltisi çıkarılarak küçük bir tüpe aktarılır. Nihai hacim kaydedilir.Nihai ürün, eksi 20 °C'de birkaç yıl boyunca saklanabilen berrak bir çözeltidir. Deneyimlerimize dayanarak, bu sıcaklıkta belirgin bir aktivite kaybı gözlemlediğimiz için IGY preparatını eksi 70 °C'de saklamayınız. Umarız, protokolümüzü takip ettiğinizde IGY ekstraksiyonunun gerçekten basit ve etkili bir prosedür olduğuna sizi ikna edebilmişizdir.Gerekli ekipman minimum düzeydedir ve harcanan emek ile elde edilen fayda arasında makul bir oran olduğuna inanıyoruz. Bu video yayınının, benim yapacağım gibi, sizleri de protokolümüzden ve teknolojimizden etkin bir şekilde yararlanmaya teşvik etmesini umuyorum. Teşekkür ederim.

igy-technology-extraction-chicken-antibodies-from-egg-yolk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, bir peptit karışımından fosfopeptitlerin antikor bazlı immünopresipitasyonunu gösteriyoruz. Zenginleştirilmiş fosfopeptitler vakumla konsantre edilir ve aşağı akış analizi için depolanır.

Fosfopeptit Zenginleştirme: Spesifik Fosforile Peptitleri Kompleks Peptit Karışımlarından Ayırmak için Antikor Bazlı Bir İmmünopresipitasyon Tekniği

Belirli genomik bölgelerle ilişkili moleküllerin tanımlanması, bu bölgelerin fonksiyonlarının düzenlenme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Bu protokol, belirli bir genomik bölge ile ilişkili proteinlerin ve RNA'ların tanımlanması için tasarlanmış DNA bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünopresipitasyonu (enChIP) gerçekleştirme prosedürlerini açıklar.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Tandem Afinite Saflaştırma (TAP) yöntemi, proteomik için başta ökaryotik olmak üzere hücresel ekstrakttan doğal kompleksleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, yapısal çalışmalar için doğal komplekslerin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü sunuyoruz.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Bu yöntem, özellikle Staphylococcus aureusgibi kompleks ana kaynaklardan gelen eksojen yağ asitleri dahil etmek için bir çerçeve sağlar. Bunu başarmak için, tavuk yumurtası sarısı ve kütle spektrometresi kullanan bakteriyel fosfolipidlerin sonraki yağ asidi profillerinden lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için protokoller açıklanmıştır.

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Bu makalede, yapısal değişimi en aza indirirken tavuk yumurtalarının dış ve iç perivitelline alt katmanlarını izole etmek ve proteomik analizler için her bir alt katmandaki protein çözünürlüğünü optimize etmek için basit bir yöntem rapor edilmektedir.

Dış ve İç Perivitellin Sublayerlerinin Tavuk Yumurtalarından Mekanik Ayrıştırılması ve Protein Solubilizasyonu

Bu protokol, piliç embriyolarında preadipositlerin yağ dokusundan izole edilmesi için basit bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek verim, primer kültür ve preadipositlerin adipojenik farklılaşması ile izolasyonu sağlar. Yağ Kırmızı O boyama ve lipid / DNA boyası, farklılaşma ortamı ile indüklenen izole hücrelerin adipojenik yeteneğini ölçtü.

Preadipositlerin Broiler Civciv Embriyolarından İzolasyonu

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Bu protokol, antijen tespiti için IgY antikorları kullanan tahliller için lateks boncukların hazırlanması için bir metodolojiyi açıklar.

Yumurta sarısı antikorlarına dayalı sitometrik boncuk testinin standardizasyonu

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Anti-Epitop Etiket Afinite Jeli ile İmmünopresipitasyon

Öğrenin, polietilen glikol çöktürme yöntemiyle yumurta sarısından IgY antikorlarının izolasyonunu. Bu basit ve uygun maliyetli protokol, immünoloji araştırmalarında yüksek verimli antikor üretimi sağlar.

IGY Teknoloji: Yumurta Sarısı Tavuk Antikorlar çıkarımı Polietilen Glikol (PEG) Yağış

Daha fazla video keşfet