Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

Transwell filtreli akış sistemlerine bağlı önceden monte edilmiş akış odalarını alın: Biri üstte endotelyal monokültür, diğeri üstte endotel kültürü ve altta stromal hücreler.

Her iki oda da bir pro-inflamatuar sitokin ile ön işleme tabi tutulur.

Bir monokültürde, sitokinler endotel hücrelerini aktive ederek adezyon molekülü ekspresyonunu yukarı regüle eder.

Bununla birlikte, ko-kültürdeki stromal ve endotelyal hücreler arasındaki çapraz konuşma, endotel hücrelerinin proinflamatuar sitokinlere tepkisini aşağı regüle eden düzenleyici mediatörler üreten stromal hücrelere yol açar.

Odayı ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu aşamasına yerleştirin.

Bir nötrofil süspansiyonu tanıtın.

Nötrofiller işe alınır ve geçici yapışkan etkileşimler yoluyla endotelyal adezyon moleküllerine bağlanır, bu da yüzeye bağlı kemokinlerle etkileşimlerini kolaylaştırır ve endotel boyunca yuvarlanır.

Bu etkileşim, nötrofiller üzerindeki integrinleri aktive eder, yapışmayı stabilize eder ve endotel hücreleri arasında transmigrasyon ile sonuçlanır.

Bununla birlikte, ko-kültürde, aşağı regüle edilmiş endotel yanıtı, baskılanmış nötrofil alımı ile sonuçlanır.

Akıştan nötrofil alımını değerlendirmek için kültürleri faz kontrast mikroskobu altında görselleştirin.

Filtre modeli için, önce metal bir şablon kullanarak cam lamel ile aynı boyutta bir Parafilm parçası kesin. Ardından, akış kanalını oluşturmak için metal bir şablon kullanarak Parafilm'de 20'ye 4 milimetrelik bir yuva açın. Cam kapak kızağı üzerindeki akış kanalını işaretlemek için Parafilm contasını kullanın. Altı kuyulu filtrenin kenarlarını cam kapak sürgüsü üzerine hizalayın. Filtrenin akış kanalı işaretlerini kapattığından emin olun. 10A tipi bir neşter kullanarak filtreyi dikkatlice kesin.

Ardından, akış kanalı yuvasının filtrenin ortasında olduğundan emin olarak filtreyi bir Parafilm conta ile dikkatlice kapatın. Bir parça temiz mendil kullanın ve baloncukları dışarı itin. Şimdi, lamel Perspex akış odasının alt plakasının girintisine yerleştirin.

Üst Perspex plakasını contanın üstüne yerleştirin ve plakaları birbirine vidalayın. PBS-A yıkama tamponunun valften akmasına izin vermek için üç musluğu çevirin. Ardından, manometre borusunu üst Perspex plakasının giriş portuna bağlayın. Kabarcıkların geçmesine izin vermek için PBS-A'yı akış kanalından geçirin.

Ardından şırınga pompasından gelen manometre borusunu Perspex plakasının çıkış portuna bağlayın. Haznenin üst plakasına damlayan PBS-A'yı temizleyin. Son olarak, odayı ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu sahnesine yerleştirin ve filtrelerin üzerindeki endotel hücrelerini görselleştirmek için odağı ayarlayın.

Lökositleri endotel hücreleri üzerine perfüze etmek için şırınga pompasını yeniden doldurmaya ayarlayın ve Çalıştır'a basın. Odak, endotel hücresi tek tabakasını görselleştirmek için ayarlandıktan sonra, numune haznesine iki mililitre saflaştırılmış nötrofil koyun ve iki dakika ısınmaya bırakın. Daha sonra endotelyumu PBS-A ile iki dakika yıkayın. Nötrofilleri endotel üzerine perfüze etmek için valfi açın. Nötrofil bolusunu dört dakika boyunca verin. Valfi kapatın ve deneyin geri kalanında PBS-A'yı yıkama haznesinden boşaltın.

Deneyi gerçekleştirirken, endotel hücresi tek tabakasını bozacağından ve yapışık nötrofillerin ayrılmasına neden olacağından, test sırasında herhangi bir noktada hava kabarcıklarının geçmediğinden emin olun.

Dijital görüntü yakalama yazılımını kullanarak nötrofil akışı sırasında veya perfüzyon sonrası nötrofil alımını kaydedin. Hedefi giriş portundaki kanalın kenarına hareket ettirerek ve portun ortasını belirleyerek kanalın merkezini belirleyin. Akış kanalının ortasındaki en az 5 ila 10 alanın tüm dijital kayıtlarını yapın.

Nötrofil akışı sırasında kayıt yaparken, bir dakika boyunca her 10 saniyede bir tek bir alanın görüntülerini alın. Kanal boyunca ilerleyin ve bir dakika boyunca başka bir alan kaydedin, bu işlemi bolus süresi boyunca tekrarlayın.

Perfüzyon sonrası kayıt için, lökosit davranışını değerlendirmek için akış kanalının merkezinden aşağı doğru 5 ila 10 alandan oluşan 10 saniyelik bir kayıt yapın. 10 saniyelik aralıkta her saniye fotoğraf çekin. Bu, akıştan yakalama ve yapışan nötrofillerin davranışının analiz edilmesi için yeterli zaman sağlar.

Beş dakika boyunca en az 10 göç etmiş nötrofil içeren tek bir alanı kaydedin ve her 30 saniyede bir görüntü çekin. Bu, taşınan hücrelerin hızını hesaplamak için kullanılabilir. 10 saniyelik alanlardan oluşan başka bir dizi kaydedin. Bu, nötrofillerin endotelyal tek tabakadan geçme süresine izin verir.

Son olarak, şırınga pompasını durdurun ve çıkış borusunu ve ardından giriş borusunu çıkarın. Akış odasını sökün ve s'yi durulayınamprezervuar PBS-A ile. Metin protokolünde açıklandığı gibi lökosit alımı ve davranışının analizine geçmeden önce sonraki filtreler ve mikro slayt kanalları için tekrarlayın.