$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hücrelerin bir yüzdesinde yaşlanmaya neden olan bir kemoterapi ilacı ile önceden tedavi edilmiş kanser hücrelerini alın.
Bu hücreler, bilinen bir yaşlanma belirteci olan otofloresan lipofusin granüllerini biriktirir.
Hücrelere giren ve lizozomal proton pompalarını inhibe eden, lizozomal asitleşmeyi önleyen bir antibiyotik ekleyin.
PH'daki bir artış lizozomal enzimleri inaktive eder.
Yaşlanan hücreler, nötre yakın pH'ta bile lizozomal β-galaktosidazı aşırı eksprese eder ve bu da onu bir yaşlanma biyobelirteç yapar.
Bir β-galaktosidaz substratı tanıtın. Kuluçkaya yatmak.
β-galaktosidaz, içselleştirilmiş substratı bir floresan ürüne hidrolize eder ve yaşlanan hücreleri etiketler.
Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Bir hücre canlılığı boyası ekleyin. Canlı hücreler içinde, aktif esterazlar boyayı zar geçirimsiz bir floresan ürüne dönüştürür. Zar bütünlüğü bozulmuş ölü hücreler lekelenmeden kalır.
Akış sitometrisini kullanarak, yaşlanan hücreleri gösteren ikili belirteçler lipofuscin ve floresan β-galaktosidaz substratını gösteren canlı hücreleri tespit edin.
İlaç etkinliğini göstermek için yaşlanan hücrelerin yüzdesini ölçün.
İlk olarak, kültürlenmiş hücre örneklerinin lizozomal pH'ını, DMEM'de bir mikromolar bafilomisin A çözeltisini, mililitre başına 10 ila altıncı hücreye bir kez konsantrasyonda hücre peletine ekleyerek ayarlayın ve karıştırmak için pipetleyin. Yavaş bir hızda bir döndürücü üzerinde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz için lekelenmek için, numunelere yıkamadan mililitre başına 10 mikrogramda DDAOG stok çözeltisi ekleyin.
Doğrudan ışıktan koruyarak 60 dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin. Daha önce olduğu gibi, tüpleri santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti PBS'de bir mililitre buz gibi% 0.5 BSA ile yıkayın. Daha sonra, yıkanmış hücre peletlerine 300 mikrolitre seyreltilmiş kalsinin menekşesi 450 çözeltisi ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
Hücre örneklerini akış sitometrisi cihazı uyumlu tüplere aktarın. Veri toplama yazılımında, bir mor kanal histogramı ve uzak kırmızı kanala karşı yeşil kanal nokta grafiği açın. Sitometre veri toplamayı düşük bir giriş hızında başlatın ve DDAOG ile boyanmış pozitif kontrol örneklerini giriş portuna yerleştirin. Örnek verileri almaya başlayın. Kanal voltajlarını, olayların %90'ından fazlası her çizimde yer alacak şekilde ayarlayın.
Tüm ayarlar optimum olduğunda, örnek başına 10.000 olay kaydedin. Yalnızca araca özel kontrol numunelerini yerleştirin.ampDDAOG ile boyanmış giriş portuna. Veri alımını başlatın ve örnek başına 10.000 olay kaydedin. Pozitif kontrole karşı otofloresan veya AF ve DDAO galaktosid sinyalinde bir artış olup olmadığına bakın. Örnek verileri içine kaydedin. FCS dosya formatını oluşturun ve dosyaları akış sitometrisi analiz yazılımı ile donatılmış bir iş istasyonu bilgisayarına aktarın.