$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Safra tuzu ile desteklenmiş, büyüme ortamındaki bakterileri veya büyüme ortamındaki bakterileri içeren kuyucuklara sahip düz tabanlı çok kuyulu bir plaka alın.
Safra tuzları strese neden olur, hücresel hasara neden olur ve DNA ve proteinleri serbest bırakır. Bu biyomoleküller kuyu diplerini kaplayarak hayatta kalan bakterilerin katı yüzeye yapışmasını sağlar.
Bağlı bakteriler çoğalır, mikro koloniler oluşturur ve otomatik indükleyiciler veya kimyasal sinyal molekülleri üreterek bakteri iletişimine izin verir.
Bu iletişim, bakterilerin kolonize olmasını ve hücre dışı polimerik maddelerin veya EPS'nin üretimini başlatmasını tetikleyerek bir biyofilm oluşturur.
Kuluçka sonrası, serbest yüzen bakterileri ortadan kaldırmak için ortamı çıkarın.
Bakteri hücre duvarının peptidoglikanı ile etkileşime giren ve ona mor bir renk veren kristal viyoletik bir leke ekleyin.
Fazla lekeyi çıkarın ve kurulayın. Bakteri hücre duvarından kristal viyoleyi çözündürmek için etanol ile kaplayın ve çözelti rengini değiştirin.
Safra tuzu ile muamele edilmiş kuyucuklarda, işlenmemiş kuyucuklara göre daha yoğun bir renklenme, katı faz yapışması yoluyla biyofilm oluşumunu doğrular.
İlk olarak, iki adet 1.5 mililitrelik tüpü TSB ve TSB artı BS olarak etiketleyin. Ardından, ilgili tüplere 1 mililitre TSB veya TSB artı BS ekleyin.
Daha sonra, tüpleri 1:50 seyreltmede 20 mikrolitre gece boyu kültür ile aşılayın. Daha sonra, steril, berrak, düz tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş, 96 oyuklu bir plakadaki üç oyuğun her birine 130 mikrolitre aşılanmamış kontrol ortamı ekleyin. Bu boş kontrol olacaktır.
Üç kuyucuğun her birine 130 mikrolitre aşılanmış kültür ekleyin. Kontrolü ve aşılanmış kültürü ilgili kuyucuklara ekledikten sonra, 96 oyuklu plakayı statik olarak 37 santigrat derecede 4 ila 24 saat inkübe edin. İnkübasyon bittiğinde, kontrolü plaka okuyucuda boş olarak ayarlayın.
Ardından, kültür ortamını her bir kuyucuktan aspire edin. Daha sonra kuyuları bir kez 200 mikrolitre steril PBS ile nazikçe yıkayın. Yıkadıktan sonra, PBS'yi aspire edin ve ardından plakayı yaklaşık 20 dakika kuruması için ters çevirin.
EPS matrisinin bozulmamasını sağlamak için ortamın nazikçe çıkarılmasını ve nazikçe yıkanmasını sağlamak çok önemlidir.
Daha sonra, deney ve kontrol kuyularının her birine 150 mikrolitre% 0.5 kristal menekşe ekleyin. Ardından, plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, kuyuları bir kez 400 mikrolitre damıtılmış su ile yıkayın. Kuyuları beş kez yıkamak için 200 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Beş yıkamanın hepsinden sonra, plakayı ters çevirin ve ışıktan koruyarak tamamen kurumasını bekleyin.
Tutarlı sonuçlar elde etmek için, devam etmeden önce numunelerin iyice kurutulması önemlidir.
Plaka tamamen kuruduktan sonra, kuyucukları lekelemek için 200 mikrolitre% 95 etanol kullanın. Daha sonra buharlaşmayı önlemek için plakayı çalkalayıcı üzerinde 4 santigrat derecede 30 dakika bekletin. 30 dakika sonra OD540'ı plaka okuyucuya kaydedin.