Mantar Hifleri Üzerinde Biyofilm Oluşturan Bakterileri Görselleştirmek için Numune Hazırlama Yöntemi

Selofan bağlı bir mantar kolonisini floresan etiketli bir bakteri süspansiyonuna sokun. Selofanı çıkarın ve inkübe edin.

Bakteri hücreleri, yüzey molekülleri ve reseptörleri aracılığıyla mantar yüzeyine yapışır. Yapışan bakteriler, polisakkaritler, proteinler ve DNA'dan oluşan hücre dışı polimerik maddeler salgılar, bakteri hücrelerini yakalar ve biyofilmin yapısal temelini oluşturur.

Gevşek bir şekilde bağlanmış bakterileri çıkarmak için bölümü güçlü bir tuz solüsyonunda durulayın

Bir fosfat tamponunda, koloninin bir bölümünü kesin.

Bölümü, buğday tohumu aglütinini veya kırmızı floresan boyaya bağlı WGA içeren steril suya aktarın.

Bir bitki proteini olan WGA, N-asetilglukozamin ve sialik asit kalıntılarına bağlanarak, eklenen boyanın mantar hücre duvarı üzerinde floresan olmasını sağlar.

Bölümü bir fosfat tamponunda durulayın.

Bir slaytı kısmen arabelleğe daldırın. Bölümün üzerinde yüzmesine izin verin. Biyofilm bozulması olmadan bölümün oturması için nazikçe kaldırın.

Bir montaj ortamı yerleştirin, ardından mikroskobik analiz için bir lamel yerleştirin.

Bakterileri gece boyunca büyüttükten sonra, kültürü üç dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleyin ve ardından peleti 25 mililitre steril 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içinde askıya alın. Santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, nihai bakteri konsantrasyonunu mililitre başına 10 ila dokuzuncu hücreye ayarlamak için aynı tamponu kullanın.

6 oyuklu bir mikroplakayı 5 mililitre bakteri süspansiyonu ile doldurun. Mantar kültürünün selofan zarını, her zarda tek bir koloni olacak şekilde kareler halinde kesmek için steril bir tıraş bıçağı kullanın. Daha sonra forseps ile, hif içeren selofan karelerini katı ortamdan dikkatlice çıkarın ve bunları bakteri süspansiyonunun ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın.

Mantar kolonileri selofandan ayrılana kadar mikroplakayı hafifçe sallayın. Ardından, mantar kolonilerini plakada bırakarak selofan tabakalarını çıkarın. Mikroplakayı, kullanılan suşlara ve analiz edilecek aşamaya bağlı olarak bir süre 20 santigrat derecede hafif çalkalama ile inkübe edin.

P. fluorescens BBc6 / L. bicolor için, erken evre biyofilmler elde etmek için kültürleri 30 dakika ve olgun biyofilmler için 16 saate kadar inkübe edin. Planktonik bakterileri ve hiflere elektrostatik olarak bağlı bakterileri uzaklaştırmak için, mantarı güçlü tuz çözeltisi ile doldurulmuş 6 oyuklu yeni bir mikroplakaya aktararak durulayın. Plakayı 1 dakika boyunca hafifçe sallayın.

Mantarı, 5 mililitre steril 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içeren 6 oyuklu yeni bir mikroplakaya aktarın. Plakayı iki dakika boyunca hafifçe çalkalayın ve ardından mantarı taze tampona aktarın.

Mantar kolonisini tamponda tutarken, koloniyi yaklaşık olarak ikiye kesmek için bir neşter kullanın. Boyanacak koloninin yarısını, Alexa Fluor633'e konjuge buğday tohumu aglutinin gibi mantar ağını görselleştirmek için uygun bir floresan boya ile desteklenmiş 1 mililitre steril su içeren bir Petri kabına aktarın. Ardından, numuneyi karanlıkta inkübe edin.

Boyamadan sonra, numuneyi 10 mililitre steril 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içeren bir Petri kabı kapağına aktararak durulayın ve 1 dakika hafifçe çalkalayın. Bir sürgüyü Petri kabı kapağına yarıya batırın ve kesilen bölümü sürgünün üzerinde yüzecek şekilde hassas bir şekilde konumlandırın. Ardından, numunenin lam üzerine nazikçe yerleşmesini sağlamak için tampon çözeltisinin yan tarafını yavaşça kaldırın.

En hassas yönü, numunenin slayt üzerindeki konumlandırılmasıdır. Biyofilm bozulmasını önlemek için, numune yerleştirilirken numune ve lam daldırılmalı ve görüntülemeden önce numune artık hareket ettirilmemelidir.

Son olarak, numuneye 10 mikrolitre solma önleyici montaj ortamı ekleyin ve üzerini bir cam lamel ile kapatın.