Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Farklı Tümör Bölgelerinde Yerleşik T Hücresi Migrasyonunun Gerçek Zamanlı Analizi

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

0 görüntüleme • 4:23 dk • July 8th, 2025

Yerleşik T hücreleri içeren bir akciğer tümörü dilimi ile başlayın.

T hücreleri, tümör mikroçevresinden göç eder ve tümör hücreleri ve stromal elementlerle etkileşime girerek bağışıklık fonksiyonlarını yerine getirir.

Tümör mikroçevresinin bileşimi, T hücresi yer değiştirmesini ve hızını güçlü bir şekilde etkiler.

Mikro ortamdaki T hücrelerini, tümör hücrelerini ve stromal elementleri etiketlemek için farklı floresan bağlanmış antikorlar ekleyin.

Çekirdeği boyamak için hasarlı bir plazma zarı olan hücrelere sızan ve tümör içindeki nekrotik bölgelerin görselleştirilmesini sağlayan DAPI'yi ekleyin.

Lekeli numuneyi konfokal mikroskop altında gözlemleyin.

Uygun bir floresan ışığı kullanarak, yerleşik T hücrelerini içeren bir tümör bölgesi seçin. DAPI pozitif hücreleri değerlendirerek hücre canlılığını değerlendirin.

Gerçek zamanlı analiz için zaman aralıklarını ve toplam kayıt süresini tanımlayın.

Z yığını görüntülerini yakalamak için, etiketli T hücrelerinin altındaki bir derinlikten başlayın ve görüntüleri çeşitli zaman aralıklarında yakalayın.

Farklı tümör bölgelerindeki T hücresi yer değiştirme uzunluğunu ve ortalama hızı karşılaştırmak için izleme yazılımını kullanın.

Gerekli floresan etiketli antikorları ve floresan nükleer boyayı, DAPI'yi fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamında gerekli nihai konsantrasyonlara seyreltin. Ardından, kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve ince bir uç kullanarak paslanmaz çelik rondelaların içindeki sıvıyı aspire edin.

Şimdi, dilime dokunmadan, her bir tümör dilimine 40 mikrolitre seyreltilmiş antikor ekleyin. Lekelenmeye izin vermek için, plakayı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Boyama adımı tamamlandıktan sonra, ince forseps kullanarak rondelaları çıkarın. Daha sonra dilimleri nazikçe çıkarın ve fenol kırmızısı içermeyen RPMI1640 ortasına 10 saniye batırın. Dilimleri hücre kültürü eklerine geri yerleştirin ve her dilimin üzerine bir damla fenol kırmızısı içermeyen RPMI1640 ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve ardından görüntülemeye devam edin.

Bu deneye başlamadan birkaç saat önce, mikroskop ısı odasının sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın, ardından mikroskobu oksijenli fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı ile tümör dilimlerini sürekli olarak perfüze etmek ve çözeltiyi bir peristaltik pompa kullanarak bir atık toplama şişesine aspire etmek için hazırlayın.

İnce forsepslerin yardımıyla, lekeli dilimi altı oyuklu plakadan kaldırın ve fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı ile doldurulmuş 35 milimetrelik plastik bir tabağa aktarın, ardından desteklemek için dilimin üzerine bir dilim ankraj yerleştirin. Ardından, bu Petri kabını mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin.

Perfüzyon sisteminin giriş ve çıkış uçlarını bağladıktan sonra, oksijenli ortamın perfüzyon tüplerinden geçmesine izin vermek için peristaltik pompayı açın. Suya daldırma objektifini dilime indirin ve parlak alan ışığıyla veya uygun dalga boyuyla dilimin üst kısmına odaklanın.

Daha sonra, uygun filtreleri kullanarak, CD8 T hücreleri, tümör adacıkları ve CD90 pozitif stromal hücreler gibi tüm floresan etiketli hücreleri içeren bir ilgi alanını görselleştirin ve seçin. Gözlemlenen floresan sinyallerin parlaklığına uyacak şekilde uygun lazer yoğunluğunu ve maruz kalma sürelerini kullanarak bir görüntüleme oturumu ayarlayın. Ardından, tümör dilimi içinde görüntü almak için Z yığını kalınlığını ayarlayın.

Ardından, belirli zaman aralıklarında görüntü yakalamak için Z yığını görüntü zaman aralığını ve toplam kayıt süresini seçin. Floresan görüntüleri yakalayıp dışa aktardıktan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi CD8 T hücre göçünü analiz edin.

11:07

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:09

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:55

Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:27

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:26

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:07

Glioblastoma Dokusunda Tümör Hücresi Migrasyonunun Hızlandırılmış Taramalı Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:21

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme Süm Min / + Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:02

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:35

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:28

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026