JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 4:11 dk. • July 8th, 2025
Mikrotübül bağlayıcı protein tau'nun tekrar alanını ifade eden bir memeli hücre kültürünü ele alalım.
Bu sitoplazmik tau raportörleri, agregasyona eğilimli bir mutasyona sahiptir ve monomerler olarak bulunur.
Raportörler, florofor A veya B'ye kaynaştırılır ve birincisinin emisyon spektrumu, ikincisinin absorpsiyon spektrumu ile örtüşür.
Tau tohumları veya tam uzunlukta tau'nun fibriler agregaları ile komplekslenmiş bir lipozom ekleyin.
Hücreye girdikten sonra, lipozom sitoplazmadaki tohumları serbest bırakır.
Serbest bırakılan tohumlar, tau muhabirlerinin toplanmasına aracılık eder ve florofor A'yı florofor B'nin yanına getirir.
Hücreleri ayırmak için tripsin ekleyin, ardından fiksasyon yapın.
Bir akış sitometresi kullanarak hücreleri analiz edin.
Agrega içindeki yakınlık nedeniyle, uyarma üzerine, bir dipol-dipol etkileşimi yoluyla florofor A'dan B'ye enerji transferi, floresan rezonans enerji transferi veya FRET olarak adlandırılır.
Uyarılmış florofor B, varlığı protein agregasyonunu gösteren bir FRET sinyali yayar.
Biyosensör hücrelerini steril koşullar altında yeniden plakalamak için, her hücre hattını ılık PBS ile durulayın ve ardından Tripsin-EDTA ile 3 dakikalık bir inkübasyon yapın. Hücreler ayrıldığında, ılık kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri hemen konik bir tüpe aktarın.
Hücreleri santrifüjleyin, peleti taze ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri sayın ve 13 mililitre ortam başına 3.500.000 hücrelik bir mastermix hücre seyreltmesi yapın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, pipet uçlarını plakanın dibine dokunmadan kuyucukların ortasına yerleştirmeye özen göstererek, düz tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 130 mikrolitre hücreyi yavaşça aktarın.
Hücreler kaplandıktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden yerleşmelerine izin verin ve ardından plakayı gece boyunca 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %80'e eşit veya daha yüksek bağıl nemde inkübe edin. Ertesi gün, biyosensör hücreleri %60 ila %65 birleştiğinde, transdüksiyon kompleksleri yapmak için indirgenmiş serum ortamı, lipozom reaktifi ve biyolojik tohum kaynağını birleştirin.
Daha sonra, her bir biyosensörün yan tarafına 20 mikrolitre transdüksiyon kompleksini nazikçe pipetleyin ve tedavi edilen hücreleri 24 ila 48 saat daha inkübatöre geri koyun. Hasattan önce, tedavi edilmemiş hücreler sadece dağınık floresan gösterecektir. Bununla birlikte, tau tohumu materyali ile muamele edilen hücreler 1 ila 2 gün sonra parlak agregalar gösterecektir.
Hücreleri hasat etmek için, hücre kültürü ortamını 50 mikrolitre Tripsin-EDTA ile değiştirin ve 5 dakika sonra reaksiyonu 150 mikrolitre soğutulmuş kültür ortamı ile durdurun. Hemen, hücreleri 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın ve hücreleri topaklayın. Peletleri rahatsız etmeden süpernatanı aspire edin ve ardından hücreleri 10 dakika boyunca 50 mikrolitre% 2 paraformaldehit içinde nazikçe ama iyice yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri tekrar döndürün ve peletleri 200 mikrolitre soğutulmuş akış sitometri tamponunda yeniden süspanse edin.