JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 4:37 dk • July 8th, 2025
Nöronal kültürleri artan konsantrasyonlarda bir test toksini ile tedavi edin.
Toksin hücrelere girer ve sitozole salınır.
Potansiyeline bağlı olarak, toksin veziküler füzyonu önleyebilir ve nörotransmitter salınımını inhibe edebilir.
Ortamı, nöronal aksiyon potansiyellerini bloke etmek için spesifik nörofarmakolojik bileşikler içeren bir tamponla değiştirin.
Kültür kabını bir elektrofizyoloji aşamasına yerleştirin. Kayda başlamak için, bir kayıt elektrodu içeren bir pipetle bir nöron soma bağlayın.
Küçük bir membran kısmını aspire etmek için sabit negatif basınç uygulayın ve kayıt sırasında minimum parazit sağlayan sıkı bir sızdırmazlık olan bir gigaseal oluşturun.
Nöronal akımları ölçmek için sabit bir membran voltajını koruyun.
Nöron ve pipet arasında doğrudan temas kurarak zarı yırtmak için negatif basınçlı darbeler uygulayın.
mEPSC adı verilen nörotransmiterlerin alımı nedeniyle nöronda üretilen akımları kaydedin.
Artan toksin maruziyeti ile mEPSC frekansındaki bir azalma, nörotransmitter salınımının inhibisyonunu gösterir.
Botulinum nörotoksin serotip A'yı ESN kültür ortamında istenen nihai konsantrasyonun 100 katına kadar seyreltin ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından, DIV 21+ ESN kültürlerine uygun miktarda toksin ekleyin. Kültür kabını döndürün ve kuluçka makinesine geri dönün.
İstenilen zaman noktasında, ESN kültür ortamını aspire edin ve hücre dışı kayıt tamponu veya ERB ile iki kez yıkayın. Daha sonra, aksiyon potansiyellerini bloke etmek için 5 mikromolar tetrodotoksin ile desteklenmiş 4 mililitre ERB ve GABAA reseptör aktivitesini antagonize etmek için 10 mikromolar bikükülin ekleyin. Ardından, çanağı elektrofizyoloji teçhizatına aktarın. Sinaptik iletimin ölçülen inhibisyonu veya MIST testi için ne perfüzyon ne de sıcaklık kontrolü gerekli değildir.
5 ila 10 megaohm dirençli borosilikat pipetleri çekmek için bir mikropipet çektirmesi kullandıktan sonra, bir pipeti hücre içi kayıt tamponu ile geri doldurun. Ardından, pipeti yavaşça silikonlaştırıcı reaktife batırın. Kayıt pipetini elektrot tutucusuna sabitleyin ve elektrot tutucusuna taşınan boruya hava dolu bir şırınga takın. Kayıt pipetini ERB'ye indirirken şırınga aracılığıyla sabit pozitif basınç sağlayın.
Kayıt pipetini kaydedilecek nöronun somasına nazikçe indirdikten sonra, şırınga üzerindeki contayı kırarak pozitif basıncı yakalayın. Şırıngayı yeniden bağlayın ve bir gigaohm contası oluşturmak için hafif inspirasyonla sürekli negatif basınç uygulayın. Gigaohm contası oluşturulduktan sonra, tutma voltajını eksi 70 milivolta düşürün, ardından toptan konfigürasyona girmek için şırıngayı kullanarak dikkatlice kısa negatif basınç darbeleri uygulayın.
Yamanın kararlı olduğunu doğrulamak için kapasitans artışlarını 30 saniye boyunca izleyin. Hacker yazılımındaki kapasitans artışlarını iptal edin ve dinlenme membranı potansiyelini izlemek ve kaydetmek için mevcut kelepçe moduna geçin. Sıvı bağlantı potansiyelleri için ayarlama yapılmadan, dinlenme membran potansiyeli eksi 67 ile eksi 82 milivolt arasında olmalıdır.
Kazancı pikoamper başına 2 milivolt olarak ayarlayın. Voltaj kelepçesi moduna geçin ve minyatür uyarıcı postsinaptik akımları tespit etmek için 3 ila 5 dakika boyunca kayıt yaparak sürekli eksi 70 milivolt gerçekleştirin.
Mini analizde AMPA reseptörü EPSC'leri için varsayılan ayarları kullanarak MEPSC'leri tespit etmek için kaydedilen 3 ila 5 dakikalık verileri analiz edin. Algılanan olaylarla ilgili bilgileri toplayın ve kaydedin. Her maruz kalma koşulu için 8 ila 12 kontrol ve 8 ila 12 botulinum nörotoksin ile tedavi edilmiş numune için mEPSC frekanslarını topladıktan sonra, frekansı yaşa ve lot eşleşen kontrollere göre analiz edin.