JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:22 dk. • July 8th, 2025
Ağır zincirli ve hafif zincirli antikor genleri için ayrı vektörler içeren bir tüp ile başlayın.
Vektörlerle kompleksler oluşturmak için bir transfeksiyon reaktifi ekleyin.
Bu karışımı memeli konakçı hücrelere aktarın ve içselleştirme için kuluçkaya yatırın.
Transfekte edilmiş hücrelerin eşit dağılımını teşvik etmek, hücre iyileşmesini ve büyümesini iyileştirmek için topaklanma önleyici bir ajan ekleyin.
Kontaminasyonu önlemek için anti-bakteriyel-anti-mikotik bir çözelti ekleyin.
Konak hücre içinde, vektörler konak genomuna entegre olur.
Gen transkripsiyonunu takiben, bireysel mRNA'lar çekirdekten çıkar ve yeni ortaya çıkan antikor zincirleri oluşturmak için translasyona uğrar.
Yeni ortaya çıkan zincirlerin uygun şekilde katlanması ve değiştirilmesi, ağır ve hafif zincirler verir.
Bu zincirler, daha sonra hücre dışı ortama salınan tamamen işlevsel antikorlar oluşturmak için birleşir.
Ortamı ve santrifüjü hasat edin. Süpernatanı filtreleyin.
Filtratı, antikorların seçici bağlanmasına izin veren bir saflaştırma kolonundan geçirin.
Bir elüsyon tamponu kullanarak, saflaştırılmış antikorları elüte edin.
CHO hücrelerini 200 mililitre ortamda uzun Erlenmeyer şaşkın şişelere büyütün. 15 mililitrelik bir tüpte 5 mililitre CHO serbest stil ortamını 50 mikrogram değişken ağır klon DNA'sı ve 75 mikrogram değişken hafif klon DNA'sı ile birleştirin. Ardından, tüpü girdaplayın. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. DNA çözeltisine mililitre polietilen amin stoğu başına 750 mikrolitre 1 miligram ekleyin ve 30 saniye boyunca agresif bir şekilde girdap haline getirin.
Karışımı 5 dakika daha oda sıcaklığında bırakın. Şişeyi manuel olarak sallarken tüm karışımı CHO hücrelerine ekleyin. 130 RPM'de çalkalarken hücreleri hemen 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, hücrelere 2 mililitre 100x topaklanma önleyici madde ve 2 mililitre 100x antibakteriyel antimikotik çözelti ekleyin. Şişeleri 32 ila 34 santigrat derecede 130 RPM'de çalkalayarak inkübe edin. Hücreleri 10 ila 11 gün boyunca kültürlemeye devam edin, her beş günde bir 10 mililitre tripton N1 beslemesi ve 2 mililitre 100x glutamin takviyesi ekleyin. Hücre canlılığının %80'in üzerinde kalmasını sağlamak için hücreleri her üç günde bir sayın. 10. veya 11. günde, kültürü 40 ila 60 dakika boyunca 3.000 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyerek antikor saflaştırması için ortamı hasat edin. Ardından, şeffaf ortamı 0,22 mikrometrelik bir şişe filtreyle filtreleyin.
Antikorları saflaştırmak için, protein A kolonunu iki kolon hacmi bağlayıcı tampon ile dengeleyin. Filtrelenmiş ortamı dakikada 1 mililitre akış hızında kolondan geçirin. Ardından sütunu iki sütun hacmi bağlayıcı tampon ile yıkayın. Antikoru 500 mikrolitrelik fraksiyonlara ayırmak için 5 mililitre elüsyon tamponu kullanın.