FA aracılı efektör fonksiyonlarının aktivasyonunun HA antikorları tarafından ölçülmesi

İnfluenza virüsü hemaglutininini veya HA'yı, küresel bir kafa ve bir saptan oluşan bir glikoproteini hedef alan bir antikorun seri dilüsyonlarını alın.

Seyreltmeleri, yüzeye bağlı HA'yı ifade eden transfekte edilmiş memeli hücrelerine ekleyin. Antikorlar, HA sap bölgelerine bağlanarak bağışıklık kompleksleri oluşturur.

Fc reseptörlerini eksprese eden ve transkripsiyon faktörü NFAT'ın kontrolü altında bir lusiferaz raportörünü kodlayan mühendislik T hücrelerini tanıtın.

İnkübasyon sırasında, HA'ya bağlı antikor Fc reseptörüne bağlanırken, HA kafası sialik aside bağlanarak T hücresi aktivasyonunu tetikler ve sitozolik kalsiyum konsantrasyonunu arttırır.

Bu aktivasyon, NFAT'ın fosforilasyonunun giderilmesiyle sonuçlanan ve nükleer translokasyonunu tetikleyen bir sinyal kaskadını başlatır.

NFAT, genomdaki yanıt elemanlarına bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu yönlendirir.

Hücre geçirgen bir biyolüminesan substrat ekleyin. Lusiferaz, substratı oksitleyerek bir sinyal üretir.

Azalan antikor konsantrasyonu ile azalan lüminesans, HA sapına özgü antikor aracılı T hücresi aktivasyonunu doğrular.

İlgilenilen spesifik antikorların hemaglutinin eksprese eden hücreleri hedefleme yeteneğini değerlendirmek için, viral olarak enfekte olmuş hücre kültürlerinin süpernatantını 25 mikrolitre antikora bağımlı hücre aracılı sitotoksisite veya ADCC, tahlil ortamı ile değiştirin.

Daha sonra, ayrı bir 96 oyuklu plakada, şematik olarak mililitre başına 10 mikrogramdan başlayarak üçlü ve taze ADCC ortamında ilgilenilen antikorların 4 kat seyreltilmesini gerçekleştirin ve arka planı dahil etmeye ve antikor kontrolü olmamasına dikkat edin.

Antikorun tamamı seyreltildiğinde, seyreltilmiş antikorun 25 mikrolitresini deney hücre plakasındaki uygun karşılık gelen kuyucuklara aktarın ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. 15 dakika sonra, 4. modifiye efektör Jurkat hücrelerine 7.5 kez 10 ekleyin, bu da oyuk başına 75 mikrolitre ADCC ortamının nihai hacmi için 25 mikrolitre ADCC ortamında oyuk başına uygun Fc reseptörünü eksprese eder.

Plakayı 6 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun, inkübasyonun son saatinde lusiferaz substrat tamponunu 37 santigrat derece su banyosunda çözdürün. Tampon hazır olduğunda, arka plan kontrol kuyusu dışındaki tüm kuyucuklara 75 mikrolitre lusiferaz substrat tamponu ekleyin ve plakayı bir luminometrede okuyun. Transfekte edilmiş veya enfekte olmuş hücre kültürlerinde antikora bağımlı hücre aracılı sitotoksisitenin kat indüksiyonu daha sonra hesaplanabilir.