JoVE Encyclopedia of Experiments
İmmünoloji
0 görüntüleme • 2:10 dk • July 8th, 2025
Ağır zincirli ve hafif zincirli antikor genleri için uygun bir katyonik polimer ve ayrı plazmit vektörleri ekleyerek bir transfeksiyon karışımı hazırlayın.
Pozitif yüklü polimer, negatif yüklü plazmitlere bağlanarak kompleksler oluşturur.
Bu transfeksiyon karışımını, serum içermeyen bir ortamda insan embriyonik böbrek hücre kültürünü içeren çok kuyulu bir plakaya ekleyin ve inkübe edin.
Kompleksler hücrelere endositoz yoluyla girerek endozomal şişmeye ve yırtılmaya neden olarak onları sitoplazmaya bırakır.
Katyonik polimer, nükleer zarda gözenekler üreterek vektör girişini kolaylaştırır ve bunların transkripsiyonunu sağlar, ardından ağır ve hafif zincirli proteinlere çevrilir.
Bu proteinler, ağır ve hafif zincirli proteinlerin dimerize edildiği ve disülfid bağları ile kovalent olarak bağlanarak antikorlar oluşturduğu endoplazmik retikuluma hareket eder.
Antikorlar, ek translasyon sonrası modifikasyonlar için Golgi aygıtına gider ve hücre dışı salınım için veziküller halinde paketlenir.
Serbest bırakılan antikorları içeren ortamı toplayın. Devam eden antikor üretimi için serum içermeyen bir ortam ekleyin.
HEK hücrelerini takviye edilmiş DMEM'de hazırlayın ve 75 santimetre karelik kültür şişelerinde %75 birleşim noktasına kadar büyütün. Her ağır / hafif zincir transfeksiyonu için, serumsuz 1.75 mililitre DMEM ile bir karışım hazırlayın. 4.5 mikrogram ağır zincir vektörü, 3 mikrogram hafif zincir vektörü ve 50 mikrolitre polietilenimin çözeltisi içerir. Bu karışımı yavaşça HEK hücrelerinden oluşan bir tabağa ekleyin ve solüsyonu plakanın üzerinde döndürün.
Plakayı gece boyunca inkübe edin ve ardından kültür ortamını her gün toplamaya başlayın ve serumsuz ortamla değiştirin. Ortam antikorları içerir ve dört gün boyunca günlük olarak toplanabilir.