JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 3:32 dk. • July 8th, 2025
Doğal öldürücü veya NK hücrelerinin bir süspansiyonunu alın.
Anti-CD20 monoklonal antikorları ekleyin ve inkübe edin.
CD20 antijenini eksprese eden hedef kanser hücrelerinin yokluğunda, antikorların Fc bölgesi, NK hücre yüzeyindeki FcγRIIIa reseptörlerine bağlanır.
Kuluçka sonrası, soğutulmuş ortam ekleyin. Bağlanmamış antikorları santrifüjleyin ve çıkarın.
Ardından, anti-insan κ hafif zincir antikorları ekleyin. Kuluçkaya yatmak.
Bu ikincil antikorlar, monoklonal antikorların κ hafif zincirine bağlanır.
Antikor çapraz bağlanması, hedef antijen bağlanmasını taklit ederek hücre içi bir sinyal kaskadını tetikler.
Bu, kanser hücrelerinin yokluğunda NK hücrelerinin yapay olarak uyarılmasına neden olur.
Aktive edilmiş NK hücreleri hücre iskeleti yeniden düzenlenmesine uğrar ve sitotoksik granüller salgılar.
Ayrıca, hücreler kemokinler ve sitokinler üretir.
İstenilen sürenin ardından, hücre stimülasyonunu durdurmak için soğutulmuş ortam ekleyin.
Tüpü santrifüjleyin. Antikor aracılı efektör NK hücre fonksiyonlarının aşağı akış analizi için süpernatan ve hücre peletini toplayın.
100 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş doğal öldürücü hücreleri 1.5 mililitrelik tüplere veya 96 oyuklu bir U-alt plakaya dağıtın ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda rituksimab veya diğer ilgili antikorları hazırlayın.
Mililitre başına 1 mikrogramlık bir son konsantrasyon için her bir hücre tüpüne 1 mikrolitre ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyon sırasında, ortamda mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonda bir anti-insan kappa hafif zincir antikoru çözeltisi hazırlayın. İhtiyaç duyulan antikor çözeltisi miktarı, hücre örneği başına 50 mikrolitre olacaktır.
Antikor çözeltisini bir ısı bloğunda veya bir su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın. Hücrelerin inkübasyonu tamamlandığında, her tüpe 1 mililitre buz gibi soğuk ortam ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 135 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Hücreleri tekrar 1 mililitre buz gibi soğuk ortamla yıkayın. Son yıkamadan sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri aktive etmek için 50 mikrolitre anti-insan kappa hafif zincir antikor çözeltisi ekleyin. Hücre örneklerini hemen 37 santigrat derecede bir ısı bloğuna veya bir su banyosuna yerleştirin ve analiz veya diğer prosedürler için istenen zaman noktalarına kadar inkübe edin.
Birden fazla numuneyi işlemenin en iyi yolu, 37 derecelik bir su banyosunda, tüm reaksiyonları hemen durdurmak için çıkarılıp buzun üzerine yerleştirilebilen yüzer bir raf kullanmaktır.