Antijene Özgü B Hücrelerinden Monoklonal Antikorlar Üretmek İçin Bir Teknik

Antijene özgü B hücrelerinden klonlanan bir antikor ağır zincirini veya bir antikor hafif zincirini kodlayan ökaryotik ekspresyon vektörlerini ele alalım.

Negatif yüklü vektörlerle elektrostatik olarak etkileşime giren ve polipleksler oluşturan katyonik bir polimer olan polietilenimi tanıtın.

Memeli hücrelerini, hücrelere yapışan ve endositoz yoluyla içselleştirilen poliplekslerle kuluçkaya yatırın. Elde edilen endozomlar lizozomlarla birleşir.

Poliplekslerdeki polimerler, vezikülün ozmotik şişmesine neden olarak yırtılmasına ve vektörlerin salınmasına neden olur.

Serbest bırakılan vektörler çekirdeğe girer ve endoplazmik retikulum üzerindeki ribozomlar yoluyla translasyona uğrayan ağır zincirli ve hafif zincirli mRNA'ya kopyalanır.

Elde edilen peptit zincirleri, Golgi'ye taşınan ve salgı veziküllerine paketlenen antikorlar halinde toplanır.

Salgı veziküllerinin ve hücre zarının füzyonu üzerine, antikorlar hücre dışı olarak salınır.

Aşağı akış tahlilleri için antikor içeren süpernatanı hasat edin.

Transfeksiyondan bir gün önce, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 200 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda 15.000 insan embriyonik böbrek hücresi tohumlayın. Ardından, plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte inkübe edin. Doğrusal bir polietilenimin türevi transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri birlikte geçirin. 0.5 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktifini 10 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür ile seyreltin.

Daha sonra, her değişken ağır ve hafif zincir eksprese eden vektörlerin 0.125 mikrogramını 10 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür içinde seyreltin. Tüm seyreltmeleri her biri 10 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra, önceden seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktifini 10 mikrolitre DNA çözeltisi ile karıştırın. DNA transfeksiyon karışımını 15 saniye boyunca hızlı bir şekilde girdap haline getirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

DNA transfeksiyon karışımını hücrelerin üzerine damla damla ekleyin ve ardından plakayı hafifçe döndürün. Transfeksiyondan 16 saat sonra ortamı değiştirin ve hücreleri 37 santigrat derecede serumsuz ortamda beş gün boyunca kültürleyin.