JoVE Deneyler Ansiklopedisi
İmmünoloji
0 görüntülenme • 2:28 dk. • July 8th, 2025
Antikor bağlayıcı bir bakteri proteini olan hareketsizleştirilmiş Protein A içeren gözenekli bir cam reçine içeren bir FPLC sütunu alın. Sütunu nötr bir pH tamponu ile dengeleyin.
Monoklonal antikorlar ve kontamine proteinler ve DNA içeren Çin hamster yumurtalık hücrelerinden hasat edilen hücre kültürü sıvısını ekleyin.
Protein A, antikorun Fc bölgesine bağlanarak onları hareketsiz hale getirir.
Bazı kirleticiler reçineye spesifik olarak yapışmazken, geri kalanı akar.
Kromatogramda, numune yüklemesi sırasında artan UV absorbansı, akışta yüksek bir protein konsantrasyonunu gösterir.
Absorbansta bir azalma ile gösterilen bağlanmamış kirleticileri çıkarmak için dengeleme tamponu ile yıkayın.
Yüksek tuzlu bir tampon ile yıkayın, spesifik olmayan etkileşimleri bozun ve küçük bir kirlilik zirvesi ile gösterilen kirleticileri çıkarın.
Protein A-antikor etkileşimini bozmak için düşük pH'lı bir elüsyon tamponu ekleyin ve karşılık gelen pikin izlenmesiyle toplanan antikorları elüte edin.
Bozunmayı önlemek için toplanan antikorların pH'ını nötralize edin.
Saflaştırma sistemine bağlı yazılımı açarak ve saflaştırılmış antikor elüatını toplamak için 15 mililitrelik konik tüpler ve yüksek tuzlu yıkama sırasında fraksiyon toplayıcıya akışı toplamak için 50 mililitrelik konik tüpler yerleştirerek başlayın.
Daha sonra, kapaklı bir nozul ile boş 12 mililitrelik bir şırıngaya 0.22 mikrometre gözenek filtreli hasat edilmiş hücre kültürü sıvısı ekleyin. Kapağı çıkardıktan sonra, şırınga memesini arıtma sisteminin manuel enjeksiyon portuna yerleştirin. Şırıngayı yerine sıkmak için çevirin ve numunenin tüm hacmi enjekte edilene ve ekteki 10 mililitrelik büyük hacimli numune döngüsünde görünene kadar pistona bastırın.
Kaydedilen yöntemi seçin ve cihaz yazılımı tarafından istendiğinde Çalıştır'a tıklayın. Antikorun tamamı ayrıştırıldığında, saflaştırılmış proteini 1 molar tris bazı ile hemen yaklaşık 5.5'lik bir pH'a kadar nötralize edin.